Toll-like receptors and macrophage polarization in the loosening of total hip replacements

The main long-term complication of the otherwise very successful total hip replacement surgery is osteolysis and resulting implant loosening that necessitate technically demanding revision operations. This aseptic loosening is primary caused by biomaterial wear particles released from the implant bearing surfaces because of abrasion. These wear particles are in the peri-implant interface tissues phagocytosed by macrophages which are induced to produce inflammatory mediators that cause the local micro-environment to support osteoclast formation and function ultimately leading to implant loosening. The exact mechanisms of this wear-particle-induced macrophage activation have remained elusive. The first aim of the current thesis was to evaluate by immunohistochemistry and qRT-PCR the extent to which Toll-like receptors (TLRs) 1-9 occur and how they localize in the aseptic interface tissues. We found that macrophages of aseptic interface tissue expressed TLR1-9 and, in comparison to control synovial tissue, actively produced all of these except TLR3 and TLR7. It is possible that some of these pattern-recognition receptors are involved in wear-particle recognition and in subsequent macrophage activation. Second, we evaluated the direct effect of titanium particles on TLR levels in a mouse model of wear-particle-induced inflammation and in a macrophage culture system. In the mouse model, particles led to down-regulation rather than to up-regulation of peri-implant TLR levels and, in the macrophage culture, particles had no effect on TLR mRNA levels. The up-regulation of TLRs in aseptic interface tissue is thus likely mediated by factors other than the direct effect of wear particles on macrophages. Third, in hopes of identifying cell populations potentially useful as histopathological diagnostic markers of subclinical implant-related infection, we evaluated cell populations present in typical implant infection and aseptic interface tissue using cell line-specific antibodies and immunohistochemistry. Comparison of inflammatory cell populations between these conditions revealed that, in addition to neutrophils, B lymphocytes and plasma cells might be useful marker cells in the diagnosis of low-grade implant-related infection, but these results must be validated in larger series. Fourth, we hypothesized that macrophages response to wear particles is dependent not only on particle characteristics but also on the state of macrophage polarization as determined by the cytokine milieu of the local microenvironment. We differentiated M1 and M2 macrophages from human monocytes and compared their responses to titanium particles using a genome-wide microarray analysis and multiplex cytokine assay. In comparison to non-activated M0 macrophages, the inflammatory responses to wear particles was greatly enhanced in M1 macrophages and effectively suppressed in M2 macrophages. These results suggest that the local, and possibly systemic, cytokine milieu is one factor determining the extent to which macrophages are activated by wear particles. Limiting the action of M1-polarizing factors in the interface tissue and promoting M2 macrophage polarization might thus be a means to limit osteolysis and implant loosening resulting from inevitably forming wear particles.Tekonivelleikkaus on erinomainen hoito loppuvaiheen lonkkanivelrikkoon. Toimenpiteen keskeisin pitkänaikavälin komplikaatio on luun syöpyminen implantin ympäriltä ja tästä johtuva tekonivelen irtoaminen, jonka vuoksi osa tekonivelistä joudutaan ennen pitkää korvaamaan uudella. Taustalla tekonivelen irtoamisessa ovat nivelen liukupinnoilta kulumisen vuoksi vapautuvat mikroskooppisen pienet muovi- ja metallipartikkelit. Puolustusjärjestelmän syöjäsolut, makrofagit, reagoivat näihin kulumapartikkeleihin tuottamalla tulehdusvälittäjiä, jotka puolestaan saavat aikaan luun syöjäsolujen, osteoklastien, muodostusta johtaen luun syöpymiseen ja nivelen irtoamiseen. Kulumapartikkeleiden aikaansaama makrofagien aktivaatio on siis keskeinen tapahtuma tekonivelen irtoamisessa mutta sen yksityiskohdat ovat huonosti tunnetut ja tämän tutkimuksen lähtökohta. Tutkimuksen ensimmäinen tavoite oli selvittää missä määrin irtoavaa tekoniveltä ympäröivässä kudoksessa ilmennetään eri Tollin kaltaisia reseptoreita (TLR). Immunohistokemialliset värjäykset sekä qRT-PCR analyysi osoittivat, että irtoavaa niveltä ympäröivän interfaasikudoksen makrofagit ilmentävät ja aktiivisesti tuottavat valtaosaa yhdeksästä eri TLR:sta. On mahdollista, että jotkin näistä muodontunnistusreseptoreista osallistuvat kulumapartikkeleiden tunnistukseen ja sitä seuraavaan makrofagien aktivaatioon. Toisena tavoitteena oli selvittää, sekä partikkelitulehduksen hiirimallia että makrofagisoluviljelmiä käyttäen, vaikuttavatko kulmapartikkelit suoraan eri TLR:n määriin. Hiirimallissa kulumapartikkelit aikaansaivat TLR:ta ilmentävien solujen lukumäärän vähenemisen ja soluviljelyssä partikkeleilla ei ollut vaikutusta TLR mRNA tasoihin. Näin ollen jotkin muute tekijät, kuin partikkeleiden suora vaikutus makrofageihin, johtaa TLR:n lisääntyneeseen määrän interfaasikudoksessa. Tutkimuksen kolmas tavoite oli löytää uusia histopatologisia menetelmiä matala-asteisen tekonivelinfektion diagnostiikkaan. Tutkimuksessa vertailtiin kulumapartikkeleiden vuoksi irtoavan ja toisaalta bakteereilla infektoituneen tekonivelen interfaasikudoksen soluprofiilia käyttäen immunohistokemiallisia värjäysmenetelmiä. Vertailu tilojen välillä osoitti, että tavanomaisesti tekonivelten histopatologisessa infektiodiagnostiikassa käytettyjen neutrofiilien lisäksi, B-lymfosyytit ja plasmasolut saattavat olla hyödyllinen merkkisolu matala-asteisesta tekonivelinfektiosta, mutta löydös on varmistettava jatkotutkimuksin. Neljäntenä tavoitteen oli arvioida hypoteesia, jonka mukaan kulumapartikkeleiden aikaansaaman makrofagiaktivaation laatu ja suuruus riippuvat paitsi partikkelin ominaisuuksista, myös sen mikroympäristön piirteistä ja tätä ympäristöstä vastaavasta makrofagien ilmiasusta, missä makrofagit partikkeleita tunnistavat. Hypoteesia testattiin soluviljelymallissa erilaistamalla ihmisen monosyyteistä kolme erilaista makrofagipopulaatiota ja vertailemalla näiden vasteita kulumapartikkeleihin. Yhdessä näistä makrofagipopulaatiosta tulehdukselliset vasteet partikkeleihin voimistuivat ja toisessa vähenivät voimakkaasti. Tulokset viittaavat siihen, että paikallinen, ja mahdollisesti myös systeeminen, sytokiiniympäristö on yksi tekijä, joka määrittelee kuinka voimakkaasti kulumapartikkelit kykenevät makrofageja aktivoimaan. Tämän ympäristön säätely, joko farmakologisesti tai biomateriaaliratkaisuin, saattaisi olla keino rajoittaa kulumapartikkeleiden aikaansaamaa makrofagiaktivaatiota