Novel neurotrophic treatments in rats and toxin sensitivity of genetically modified mice in the unilateral 6 OHDA model of Parkinson's disease

Parkinson s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by various motor and non-motor dysfunctions. The motor symptoms are mainly due to the death of dopaminergic (DAergic) neurons in the substantia nigra, which leads to loss of neurotransmitter dopamine (DA) in the striatum and thus, to impairments in controlling movements. The causes behind PD are rather poorly understood but are likely to arise from genetic and environmental factors and their interactions. Current therapies for PD can only alleviate the symptoms, and there is a great need for interventions that could slow down the progression of the disease. Neurotrophic factors (NTFs) are polypeptides that regulate the development and survival of neurons, and therefore are promising molecules for the treatment of neurodegenerative disorders. Glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) is a potent NTF for DAergic neurons, and the discovery of novel NTFs could stimulate the development of regenerative therapies. A widely used tool in preclinical PD research to assess neurotrophic potential is the unilateral 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model in rodents. Furthermore, genetically modified mice can be useful in dissecting the mechanisms of neurodegeneration and identifying gene-environment interactions. The aims of this thesis were to study the neurotrophic potential of a structurally modified GDNF variant and vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) in the unilateral 6-OHDA rat model of PD. Furthermore, the effects of 6-OHDA was assessed in two genetically modified mouse strains: one with a constitutively active GDNF -signalling receptor RET and the other expressing human A30P-mutated alpha-synuclein (aSyn). We showed that the removal of first 38 amino acids from the protein sequence of GDNF increases its diffusion in the rat brain, but when compared with the full GDNF, is less effective in inducing behavioural recovery and protection of DAergic neurons. It is believed that GDNF is presented to its receptors by heparan sulphate proteoglycans of the extracellular matrix. The lack of heparin-binding domain may therefore lead to insufficient survival signalling. VEGF-C was identified as a neurotrophic factor for midbrain DAergic neurons. Pretreatment with VEGF-C before 6-OHDA lesioning could effectively attenuate behavioural deficits in rats despite modest effects on DAergic neuronal survival. VEGF-C was not effective when given one month after 6-OHDA lesioning. Furthermore, gliosis and disruption of the blood-brain barrier were observed after VEGF-C injection. The studies on genetically modified mice showed that constitutive RET signalling can protect nigral DAergic neurons in MEN2B knock-in mice against 6-OHDA despite substantial depletion of striatal DA. The expression of A30P-aSyn did not sensitize the mice to the neurotoxic effects of 6-OHDA, but they exhibited an attenuated locomotor response to D-amphetamine and developed notable motor defects with age. In conclusion, these studies provided new insights into the neuroprotective signalling of GDNF, lead to the identification of VEGF-C as a neurotrophic factor for DAergic neurons, and demonstrated that despite affecting the motor phenotype of mice, the expression A30P-aSyn does not sensitize the mice to the effects of 6-OHDA.Parkinsonin tauti on etenevä, liikehäiriöitä ja muita hermostollisia oireita aiheuttava hermorappeumasairaus. Liikehäiriöt ovat pääasiassa seurausta aivojen mustatumakkeen dopamiinia sisältävien hermosolujen kuolemasta. Taudin syntyperä on edelleen avoin, mutta tunnetaan useita perinnöllisiä ja ympäristöllisiä tekijöitä, joiden syy-yhteys tautiin on vahva. Nykyinen lääkehoito lievittää potilaiden oireita, mutta ei hidasta taudin etenemistä, mistä johtuen hermosoluja suojaavien hoitomuotojen tarve on suuri. Hermokasvutekijät ovat hermosolujen kehitystä ja säilymistä sääteleviä proteiineja, jotka saattaisivat soveltua hermorappeumasairauksien hoitoon. Ennen kliinisiä kokeita uusia lääkeaine-ehdokkaita on tutkittava koeputkiolosuhteissa sekä sairauksien eläinmalleissa. Parkinsonin taudin tutkimuksessa käytetään laajasti mallia, joka perustuu dopamiinia matkivan hermomyrkyn, 6-hydroksidopamiinin (6-OHDA), käyttöön jyrsijöillä. Tätä hermomyrkkyä voidaan myös hyödyntää tutkittaessa perimältään muunneltujen hiirien dopamiinisolujen rappeumaherkkyyttä, mistä voidaan saada tietoa tietyn geenin asemasta hermorappeumassa. Tässä väitöstyössä tutkittiin rakenteellisesti muunnellun gliasoluperäisen hermokasvutekijän (GDNF) sekä imu- ja verisuonistoon vaikuttavan vaskulaarisen endoteelikasvutekijä C:n (VEGF-C) dopamiinihermosoluja suojaavia vaikutuksia 6-OHDA:lla käsitellyissä rotissa. Lisäksi tutkittiin 6 OHDA:n vaikutuksia kahdessa muuntogeenisessä hiirikannassa: ensimmäinen tuotti jatkuvasti aktiivista GDNF:n viestiä välittävää reseptoria RET:ä, ja toinen ihmisen A30P-muuntunutta alfasynukleiini-proteiinia, joka on yhdistetty harvinaiseen perinnölliseen Parkinsonin taudin muotoon. Tutkimuksissa havaittiin, että GDNF:n rakenteen ensimmäisten 38 aminohapon poistaminen parantaa sen leviämistä rottien aivokudoksessa huomattavasti, mutta alentaa sen hoitavaa tehoa. Kyseinen rakenteen muutos heikentää sitoutumista aivojen hepariinin kaltaisiin proteiineihin, jotka osallistuvat GDNF:n vaikutusten välittämiseen, ja siksi muunnellun proteiinin teho alenee. Toisessa osatyössä osoitettiin VEGF-C:llä olevan suojaavia vaikutuksia 6-OHDA -rottamallissa. Mallille tunnusomainen, dopamiinihermovauriota kuvaava pyörimiskäyttäytyminen väheni merkitsevästi, vaikka VEGF-C:n vaikutus dopamiinihermosolujen elossasäilymiseen oli vaatimaton. Lisäksi VEGF-C:n huomattiin aiheuttavan aivojen hermotukisolujen tulehdusreaktion kaltaista aktivoitumista, sekä veri-aivoesteen häiriöitä. Kokeet muuntogeenisillä hiirillä osoittivat, että jatkuva RET-aktivaatio suojelee mustatumakkeen dopamiinihermosoluja 6-OHDA:n vaikutuksilta, vaikka hermojen päätealueet tuhoutuvat merkitsevästi. Siten kyseisellä reseptorilla vaikuttaisi olevan erilainen vaikutus solukeskusten ja viejähaarakkeiden säilymisessä. A30P-alfasynukleiinin ilmentyminen hiirissä ei lisännyt dopamiinihermosolujen herkkyyttä 6-OHDA:lle, mutta hiirillä oli alentunut liikeaktiivisuusvaste amfetamiinille, ja niille kehittyi iän myötä liikehäiriöitä. Tässä väitöstyössä saatiin uutta tietoa GDNF:n hermosoluja suojaavasta viestinnästä sekä havaittiin VEGF-C:llä olevan positiivisia vaikutuksia Parkinsonin taudin eläinmallissa. Lisäksi todettiin, että ihmisen A30P-muuntuneen alfasynukleiinin ilmentäminen hiirten aivoissa ei herkistä hermomyrkky 6-OHDA:n vaikutuksille