Molecular typing and source attribution of Finnish Campylobacter jejuni isolates

Campylobacter is the main bacterial genus of gastroenteritis in Finland and C. jejuni accounts for more than 90% of the Campylobacter infections. The majority of infections occur during the summertime (June-August). Risk factors associated with the disease are the handling and consumption of undercooked chicken meat, drinking of raw milk or contaminated water and foreign travel. Nevertheless, the source of Campylobacter often remains obscure, due to the sporadic nature of the infection. Multilocus sequence typing (MLST) has been proven to be useful in molecular epidemiology and source attribution studies of this zoonotic food- and water-borne pathogen. Using MLST, we typed 454 C. jejuni isolates from domestically acquired human infections and 208 isolates from chicken meat and caecal samples collected between 1996 and 2006. In this study period, clonal complexes (CCs) ST-45, ST-21 and ST-677 covered 73.9% of all isolates. The annual overlap between STs from human and chicken isolates decreased from 76% in 1999 to 58% in 2006. CC ST-677 occurred with an increasing trend among chicken isolates, but with a decreasing trend among human isolates. A high ST diversity was revealed among 102 Finnish bovine C. jejuni isolates. CC ST-21 alone accounted for 56% of the bovine C. jejuni isolates and encompassed 23 different STs. CC ST-61 was the second largest CC and included 20% of the isolates. Source attribution was determined by the Bayesian Analysis of Population Structure (BAPS) program, which showed that 44.3% of the human isolates were found in the bovine-associated BAPS cluster; 45.4% were found in the chicken-associated BAPS cluster and 10.3% remained unassigned. A high diversity of STs including novel and unassigned STs were found among the 113 C. jejuni isolates sampled from natural water bodies, wild birds and zoo animals. However, the most common ST found among human and poultry isolates, ST-45, was also the most common ST typed among the natural water body isolates. In the BAPS analysis 65.4% of the human isolates grouped into the poultry-associated cluster. A new cluster associated with natural water bodies emerged that largely consisting of uncommon and unassigned STs. Population differentiation revealed that the human and poultry populations and the human and natural water populations were the most similar to each other. The distributions of fspA1 and fspA2 among isolates taken from different sources and STs were studied. The human and poultry isolates, in addition to CC ST-45 and ST-283 were associated with fspA1, whereas the bovine isolates, CC ST-21 and ST-61 were associated with fspA2. FspA1 was highly conserved among the strains in contrast to fspA2, which was profoundly heterogeneous. Sequence analysis of the fspA2 allele in different STs showed that several predicted protein sequences contained premature stop codons. The presence of certain unique metabolic traits was found in some but not all C. jejuni strains. Gamma-glutamyl transpeptidase (GGT) and the gene for periplasmic L-asparaginase (ansBs) were often mutually exclusive with fucose permease (fucP). This particular combination, and also the presence of fucP only was highly ST dependent. The exception to this phenomenon was ST-45, which was very heterogeneous. Total absence of all studied metabolic traits occurred in 22% of the strains. The research conducted here conclusively showed a great diversity of C. jejuni STs among the human, bovine and environmental isolates. The overlap between Finnish human and chicken C. jejuni isolates declined between 1999 and 2006. However, natural waters could be an underestimated source of infection. Pronounced fspA2 diversity was found. The distribution of the secondary metabolic traits GGT, ansBs and fucP was promiscuous among the isolates obtained from different sources which suggests that animal colonization and human infection are not necessarily dependent on these traits.Campylobacter jejuni on yleisin bakteeriripulin aiheuttaja useissa teollistuneissa maissa. Suomessa rekisteröitiin vuonna 2011 kaikkiaan 4262 tautitapausta. Tapausten todellisen lukumäärän arvioidaan kuitenkin olevan paljon korkeampi. Tauti on useimmiten elintarvike- tai vesiperäinen. Taudin oireisiin kuuluu mm. ripuli, kuume, oksentelu ja päänsärky. Suuri osa tapauksista liittyy ulkomaan matkaan ja vain n. 1/3 tapauksista on kotimaista alkuperää. Valtaosa tartunnoista on yksittäisiä tautitapauksia jonka takia esim. kotimaisten tartuntojen lähteitä on vaikea selvittää potilaskohtaisesti. C. jejunia esiintyy useiden lämminveristen eläinten ruoansulatuskanavassa. Eläimet toimivat bakteerin oireettomina kantajina ja varastoina ihmisten tartunnoille. Erityisesti broilereiden suolistossa C. jejuni on yleinen, vaikkakin Suomessa C. jejunia esiintyy broilerin tuotannossa huomattavasti vähemmän kuin muissa EU maissa. Broilerien lisäksi C. jejunia esiintyy myös mm. naudoissa ja luonnonvaraisissa linnuissa. Kissat ja koirat voivat myös toimia bakteerin kantajina. Ulostesaastutuksen seurauksena C. jejunia löytyy myös ympäristöstä, erityisesti luonnonvesistä. Ihmisten tartuntalähteiden selvitystyössä voidaan käyttää apuna bakteerikantojen molekyylibiologista tyypitystä, kuten MLST:tä (MultiLocus Sequence Typing). Tässä menetelmässä bakteeri-isolaatit voidaan erottaa toisistaan sekvenssidatan perusteella. Kukin bakteerikanta saa sekvenssityyppi (ST) numeron, mikä helpottaa tulosten analysointia ja vertailua. Sekvenssidataa voidaan myös analysoida ja mallintaa matemaattisesti (esim. Bayes-mallinnus, mm. BAPS), jonka avulla bakteeri-isolaatit voidaan ryhmitellä ja tulosten perusteella estimoida eri tartuntalähteiden merkitystä ihmisten tartunnoissa. Tässä väitöstutkimuksessa tyypitimme C. jejuni kantoja MLST menetelmää ja Bayesiläistä mallinnusta apuna käyttäen. Kantakokoelman kannat oli eristetty n. 10 vuoden aikana mahdollisista tartuntalähteistä, kuten broilerit, naudat, hanhet ja luonnonvesi sekä potilaista, jotka olivat sairastuneet Suomessa. Selvitimme myös kuinka C. jejuni populaatiot ovat muuttuneet ihmisten tartunnoissa ja broilereissa vuosina 1999-2006. Potilaskannoissa esiintyi paljon yhteisiä C. jejuni tyyppejä broilerikantojen kanssa. Havaitsimme kuitenkin tiettyjen yleisten tyyppien esiintymisessä myös vastakkaisia suuntauksia potilas- ja broilerikantojen välillä. Esimerkiksi potilaskannoissa tyypin ST-677 CC suhteellinen osuus pieneni merkittävästi tutkimusajanjakson loppua kohden kun taas broilerikantojen joukossa samainen tyyppi oli vuosi vuodelta yleisempi. Vastaavanlaisia muutoksia nähtiin myös eräiden muiden sekvenssityyppien kohdalla. Tutkimusjakson lopulla potilas- ja broilerikantojen tyyppien päällekkäisyys oli pienentynyt 20%:lla tutkimuksen alkuun nähden mikä tarkoittanee että broilerien rooli kotimaisten tautitapausten tartuntalähteenä oli pienentynyt tutkimusajanjaksolla. MLST sekvenssien ja BAPS analyysin perusteella siipikarja ja vesi vaikuttivat kuitenkin todennäköisimmiltä tartuntalähteiltä kotimaisissa tautitapauksissa. Luonnonvesissä tosin esiintyi myös paljon erikoisia ja harvinaisia sekvenssityyppejä mikä puolestaan viittaa siihen että kaikki vedessä esiintyvät C. jejuni kannat eivät välttämättä kykene aiheuttamaan tartuntoja ihmisille. Naudoissa ja luonnonvaraisissa linnuissa tavatut C. jejuni tyypit muodostivat ryhmän erillään ihmisissä, broilereissa ja vedessä esiintyneistä tyypeistä. Vaikka osa potilaskannoista ryhmittyi nautakantojen kanssa, yhteys nautakantojen kanssa ei kuitenkaan ollut yhtä vahva kuin yhteys broileri- ja vesikantojen kanssa. Lopuksi selvitimme myös mahdollisten virulenssitekijöiden (FspA, GGT, AnsBs ja FucP) esiintyvyyttä kantakokoelmassamme. Tilastollisesti merkitsevä yhteys potilaskantojen osalta löydettiin ainoastaan FspA1 kanssa. FspA1 ja 2 proteiinit liittyivät tilastollisesti tiettyihin C. jejuni tyyppeihin ja niillä on mahdollisesti merkitystä bakteerin adaptaatioon eri isäntälajeissa ja kolonisaatiokykyyn, erityisesti CC ST-48 osalta. Muiden tutkittujen tekijöiden heterogeeninen jakautuminen eri lähteiden ja sekvenssityyppien välillä viittaa siihen, että näiden tekijöiden vaikutus adaptoitumiseen, kolonisoitumiseen sekä taudinaiheuttamiseen ei ehkä ole ratkaiseva