The function of NR3B and NR4A orphan nuclear receptors in osteoblasts

Nuclear receptors (NRs) comprise a large family of proteins that mediate the effects of small lipophilic molecules such as steroid hormones. In addition, there are a group of NRs which lack identified natural ligands and are referred as orphan NRs. In this thesis, the function of two such orphan NR families, the NR3B (ERRα, ERRβ and ERRγ) and the NR4A family (NGFI-B, Nurr1 and Nor1), was studied. NR3B and NR4A receptors regulate many biological processes such as energy metabolism and carcinogenesis. In addition, NR3B and NR4A receptors are expressed in bone. Therefore, the signaling and function of NR3B and NR4A orphan nuclear receptors was studied specifically in osteoblasts. NR4A receptors were found to be regulated by NR3B receptors and the Wnt/β-catenin signaling pathway as ERRα, ERRγ and β-catenin repressed the transcriptional activity of NR4A receptors in U2-OS cells. NGFI-B was found to repress the transcriptional activity of ERRγ in HeLa cells. The phytoestrogen equol was identified as a new agonist for ERRγ and ERRβ in PC-3, U2-OS, and SaOS-2 cells. Equol increased the transcriptional activity of ERRγ by increasing ERRγ co-activator binding and by inducing a conformational change in the ligand binding pocket of ERRγ. The growth inhibitory effect of equol on PC-3 prostate cancer cells was decreased by blocking ERRγ expression by siRNA. Therefore, ERRγ could mediate some of the beneficial health effects of equol. The Wnt/β-catenin signaling pathway is important for the differentiation and function of osteoblasts. NR3B and NR4A receptors were found to repress the transcriptional activity mediated by β-catenin in U2-OS cells. The mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from ERRα knockout (KO) mice showed diminished proliferation and osteoblastic differentiation compared to the wild-type cells. The overexpression of ERRα in osteoblastic MC3T3-E1 cell line increased their mineralization. Bone sialoprotein (BSP) was shown to be a direct target gene for ERRα and ERRγ as the BSP promoter was activated by ERRα or ERRγ and PGC-1α in HeLa cells. The adipogenic differentiation of ERRα KO MSCs was also decreased and they expressed less adipogenic marker genes. In conclusion, the studies described in this thesis demonstrated that the transcriptional activity of NR3B and NR4A receptors can be regulated by other orphan NRs and signaling pathways in osteoblasts. NR3B receptors can also be regulated by ligands and a new agonist, equol, was identified for ERRβ and ERRγ. New roles for NR3B and NR4A were also identified as they were shown to converge with the Wnt signaling pathway in osteoblasts, ERRγ was shown to mediate the growth inhibitory effect of equol in prostate cancer cells, and ERRα was shown to regulate positively MSC proliferation, osteoblastic differentiation and adipogenesis.Tumareseptorit ovat solunsisäisiä reseptoreita, jotka välittävät vasteita pienille rasvaliukoisille molekyyleille. Perheeseen kuuluu myös reseptoreita, joille ei ole löydetty fysiologista ligandia ja joita kutsutaan orvoiksi tumareseptoreiksi. Väitöskirjatutkimus keskittyi kahteen orpoon tumareseptoriperheeseen: NR3B-perhe käsittää reseptorit ERRα, ERRβ ja ERRγ ja NR4A-perhe reseptorit NGFI-B, Nurr1 ja Nor1. NR3B- ja NR4A-reseptoreiden on havaittu säätelevän monia biologisia prosesseja ja osallistuvan mm. energia-aineenvaihduntaan ja karsinogeneesiin. Kummatkin reseptoriperheet ilmenevät myös luussa. Siten väitöskirjatyössä pyrittiin selvittämään NR3B- ja NR4A-reseptoreiden toimintaa ja merkitystä erityisesti luun osteoblasteissa. Tutkimuksessa löydettiin kaksi uutta signalointireittiä, jotka säätelevät NR4A-perheen toimintaa. Sekä NR3B-reseptoreiden että Wnt/β-kateniini-signaalireitin todettiin estävän NR4A-perheen transkriptionaalista aktiivisuutta osteoblasteissa. NR4A-perheen puolestaan havaittiin estävän NR3B-reseptoreiden transkriptionaalista aktiivisuutta. NR3B-perheelle löydettiin uusi agonisti, fytoestrogeeni equol. Equol lisäsi ERRβ:n ja ERRγ:n transkriptionaalista aktiivisuutta PC-3 prostatasyöpäsoluissa sekä U2-OS ja SaOS-2 osteosarkoomasoluissa. ERRγ lisäsi equolin prostatasyöpäsolujen kasvua vähentävää vaikutusta. Siten ERRγ saattaa välittää equolin terveysvaikutuksia. Wnt/β-kateniini-signaalireitillä on suuri merkitys osteoblastien kehitykselle ja toiminnalle. Sekä NR3B- että NR4A-perheen havaittiin vähentävän Wnt/β-kateniini-signaalireitin aktiivisuutta U2-OS-soluissa. Osteoblastit erilaistuvat luuytimen mesenkymaalisista kantasoluista. ERRα:n havaittiin lisäävän hiiren mesenkymaalisten kantasolujen jakaantumista ja erilaistumista sekä osteoblasteiksi että adiposyyteiksi. ERRα:lle ja ERRγ:lle löydettiin myös uusi kohdegeeni, bone sialoprotein. Säätelemällä mesenkymaalisten kantasolujen jakaantumista ja erilaistumista ERRα saattaa vaikuttaa luun muodostukseen ja huoltoon, ja siten mm. osteoporoosin syntyyn. Väitöskirjatyössä löydettiin siten monia uusia mekanismeja, joiden avulla orpojen NR3B- ja NR4A- reseptoreiden toimintaa voidaan säädellä osteoblasteissa. Lisäksi reseptoreille löydettiin uusia merkityksiä mesenkymaalisten kantasolujen erilaistumisen ja Wnt/β-kateniini-signalointireitin aktiivisuuden säätelijänä ja fytoestrogeenien vaikutusten välittäjänä