Inhibition of Thrombin in Cardiac Surgery : experiments in a porcine model

Cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass (CPB) induces activation of inflammation and coagulation systems and is associated with ischemia-reperfusion injury (I/R injury)in various organs including the myocardium, lungs, and intestine. I/R injury is manifested as organ dysfunction. Thrombin, the key enzyme of coagulation , plays a cenral role also in inflammation and contributes to regulation of apoptosis as well. The general aim of this thesis was to evaluate the potential of thrombin inhibition in reducing the adverse effects of I/R injury in myocardium, lungs, and intestine associated with the use of CPB and cardiac surgery. Forty five pigs were used for the studies. Two randomized blinded studies were performed. Animals underwent 75 min of normothermic CPB, 60 min of aortic clamping, and 120 min of reperfusion period. Twenty animals received iv. recombinant hirudin, a selective and effective inbitor of thrombin, or placebo. In a similar setting, twenty animals received an iv-bolus (250 IU/kg) of antithrombin (AT) or placebo. An additional group of 5 animals received 500 IU/kg in an open label setting to test dose response. Generation of thrombin (TAT), coagulation status (ACT), and hemodynamics were measured. Intramucosal pH and pCO2 were measured from the luminal surface of ileum using tonometry simultaneusly with arterial gas analysis. In addition, myocardial, lung, and intestinal biopsies were taken to quantitate leukocyte infiltration (MPO), for histological evaluation, and detection of apoptosis (TUNEL, caspase 3). In conclusion, our data suggest that r-hirudin may be an effective inhibitor of reperfusion induced thrombin generation in addition to being a direct inhibitor of preformed thrombin. Overall, the results suggest that inhibition of thrombin, beyond what is needed for efficient anticoagulation by heparin, has beneficial effects on myocardial I/R injury and hemodynamics during cardiac surgery and CPB. We showed that infusion of the thrombin inhibitor r-hirudin during reperfusion was associated with attenuated post ischemia left ventricular dysfunction and decreased systemic vascular resistance. Consequently microvascular flow was improved during ischemia-reperfusion injury. Improved recovery of myocardium during the post-ischemic reperfusion period was associated with significantly less cardiomyocyte apoptosis and with a trend in anti-inflammatory effects. Thus, inhibition of reperfusion induced thrombin may offer beneficial effects by mechanisms other than direct anticoagulant effects. AT, in doses with a significant anticoagulant effect, did not alleviate myocardial I/R injury in terms of myocardial recovery, histological inflammatory changes or post-ischemic troponin T release. Instead, AT attenuated reperfusion induced increase in pulmonary pressure after CPB. Taken the clinical significance of postoperative pulmonary hemodynamics in patients undergoing cardiopulmonary bypass, the potential positive regulatory role of AT and clinical implications needs to be studied further. Inflammatory response in the gut wall proved to be poorly associated with perturbed mucosal perfusion and the animals with the least neutrophil tissue sequestration and I/R related histological alterations tended to have the most progressive mucosal hypoperfusion. Thus, mechanisms of low-flow reperfusion injury during CPB can differ from the mechanisms seen in total ischemia reperfusion injury.Sydänkeuhkoneen käyttö ja kirurginen vamma käynnistävät elimistössä voimakkaan tulehdus- ja hyytymisjärjestelmän aktivaation. Avosydänleikkauksissa sydän pysäytetään ja sen verenkierto estetään toimenpiteen ajaksi. Lisäksi sydänkehkokoneen käytön aikainen poikkeava verenkierto voi johtaa muidenkin elinten kuten suolen ja keuhkojen toimintahäiriöön. Erityisesti elinten verenkierron palautumisvaiheeseen, ns. reperfuusiovaiheesen, liittyy paikallinen nopea tulehdus- ja hyytymismekanismin monimutkainen ja osin yhteensidottu aktivoituminen, jossa trombiinilla näyttäisi olevan keskeinen asema. Trombiinilla tiedetään olevan myös apoptoosia aktivoivia ominaisuuksia. Tämän tutkimussarjan yleistavoitteena oli selvittää voidaanko sydänkirurgiaan ja sydänkeuhkokoneen käyttöön liittyvässä iskemia-reperfuusiotilanteessa sydänlihaksen, keuhkojen ja suoliston toipumista edistää eri mekanismeilla toimivilla trombiinin estäjillä. Sisällyttämällä koeasetelmaan kaksi eri mekanismilla toimivaa trombiininestäjää (hirudiini, antitrombiini) ja mittaamalla samanaikaisesti sekä hyytymismekanismin aktivaatiota että inflammatorista vastetta pyrittiin erittelemään välittyykö mahdollinen toipumista edistävä mekanismi puhtaasti trombiinin eston kautta ja onko antitrombiinin trombiinin estosta erillisellä anti-inflammatorisella vaikutuksella merkitystä. Kyseessä oli avosydänkirurginen koeasetelma sialla, jossa eläin kytkettiin sydänkeuhkokoneeseen. Satunnaistetusti ja sokotetusti 15 min ennen yhden tunnin sydänlihasiskemian loppua sian verenkiertoon annettiin tutkimuslääkettä tai placeboa. Sydämen hemodynaamista toipumista seurattiin kahden tunnin ajan ja samalla mitattiin sekä hyytymisaktivaatiota trombiinin muodostuksen tasolla että inflammatorista vastetta verinäytteistä ja sydän- ja suolibiopsioista. Kahden tunnin reperfuusiovaiheen jälkeen sydänlihaksesta, keuhkoista ja suolesta otettiin koepalat histologista tarkastelua ja apoptoosin määrittämistä varten. Lisäksi suoliston verenkiertoa mitattiin epäsuorasti ohutsuoleen asetetun tonometria katetrin avulla perfuusion aikana ja sen jälkeen. Yhteenvetona osatöiden tuloksista todettiin, että hirudiini estää sekä reperfuusion aikaista trombiinin muodostusta että jo muodostunutta trombiinia, jolla on edullisia vaikutuksia sydänlihaksen toipumiseen iskeemisestä stressistä, systeemiverenkierron vastukseen ja suoliston mikroverenkiertoon. Sydänlihaksen koepaloista mikroskoopilla tehdyssä analyysissä mikrotromboosia ei todettu mutta sydänlihaksen parempaan toipumiseen liittyi hirudiinia saaneilla eläimillä tulehdussolujen vähäisempi määrä ja apoptoosia esiintyi merkittävästi vähemmän kuin kontrolleilla. Johtopäätöksenä oli, että reperfuusion aikaisen trombiinin muodostuksen estolla näyttäsi olevan muitakin edullisia vaikutuksia sydänlihaksen toipumisessa kuin hyytymisjärjestelmän aktivaation esto. Antitrombiinin veren hyytymistä estävä vaikutus tuli selvästi esille mutta antitrombiini ei vähentänyt reperfuusion aikaista trombiinin muodostusta. Antitrombiini ei estänyt sydänlihaksen histologista vauriota ja vaikutus minuuttivolyymiin ja isku-tilavuuteen oli vain lyhytaikaista ja ohimenevää. Sen sijaan antitrombiini näytti merkittävästi estävän reperfuusiovaiheen keuhkovaltimopaineen ja –vastuksen nousua. Suolen seinämän tulehduksellinen vaste ei assosioitunut suolen limakalvon huonontuneeseen verenkiertoon vaan päinvastoin. Tämä löydös oli vastoin aiempia kokeellisilla suolen verenkierron kokonaan estetyillä malleilla tehtyjä havaintoja. Tulos viittaa siihen, että sydänkeuhkokoneen aiheuttama verenkierron low-flow tilanteen reperfuusiovaurion mekanismit ja sen seuraukset suolen seinämässä poikkeavat totaalin iskemia-reperfuusio vaurion mekanismeista