Pathobiological Aspects of Nonreheumatic Aortic Valve Stenosis

Aortic valve stenosis (AS) is an active disease process akin to atherosclerosis, with chronic inflammation, lipid accumulation, extracellular matrix remodeling, fibrosis, and extensive calcification of the valves being characteristic features of the disease. The detailed mechanisms and pathogenesis of AS are still incompletely understood, however, and pharmacological treatments targeted toward components of the disease are not currently available. In this thesis project, my coworkers and I studied stenotic aortic valves obtained from 86 patients undergoing valve replacement for clinically significant AS. Non-stenotic control valves (n=17) were obtained from patients undergoing cardiac transplantation or from organ donors without cardiac disease. We identified a novel inflammatory factor, namely mast cell, in stenotic aortic valves and present evidence showing that this multipotent inflammatory cell may participate in the pathogenesis of AS. Using immunohistochemistry and double immunofluorescence stainings, we found that a considerable number of mast cells accumulate in stenotic valves and, in contrast to normal valves, the mast cells in diseased valves were in an activated state. Moreover, valvular mast cells contained two effective proteases, chymase and cathepsin G, which may participate in adverse remodeling of the valves either by inducing fibrosis (chymase and cathepsin G) or by degrading elastin fibers in the valves (cathepsin G). As chymase and cathepsin G are both capable of generating the profibrotic peptide angiotensin II, we also studied the expression and activity of angiotensin-converting enzyme (ACE) in the valves. Using RT-PCR, imunohistochemistry, and autoradiography, we observed a significant increase in the expression and activity of ACE in stenotic valves. Besides mast cell-derived cathepsin G, aortic valves contained other elastolytic cathepsins (S, K, and V). Using immunohistochemistry, RT-PCR, and fluorometric microassay, we showed that the expression and activity of these cathepsins were augmented in stenotic valves. Furthermore, in stenotic but not in normal valves, we observed a distinctive pattern of elastin fiber degradation and disorganization. Importantly, this characteristic elastin degradation observed in diseased valves could be mimicked by adding exogenous cathepsins to control valves, which initially contained intact elastin fibers. In stenotic leaflets, the collagen/elastin ratio was increased and correlated positively with smoking, a potent AS-accelerating factor. Indeed, cigarette smoke could also directly activate cultured mast cells and fibroblasts. Next, we analyzed the expression and activity of neutral endopeptidase (NEP), which parallels the actions of ACE in degrading bradykinin (BK) and thus inactivates antifibrotic mechanisms in tissues. Real-time RT-PCR and autoradiography revealed NEP expression and activity to be enhanced in stenotic valves compared to controls. Furthermore, both BK receptors (1 and 2) were present in aortic valves and upregulated in stenotic leaflets. Isolated valve myofibroblasts expressed NEP and BK receptors, and their upregulation occurred in response to inflammation. Finally, we observed that the complement system, a source of several proinflammatory mediators and also a potential activator of valvular mast cells, was activated in stenotic valves. Moreover, receptors for the complement-derived effectors C3a and C5a were expressed in aortic valves and in cultured aortic valve myofibroblasts, in which their expression was induced by inflammation as well as by cigarette smoke. In conclusion, our findings revealed several novel mechanisms of inflammation (mast cells and mast cell-derived mediators, complement activation), fibrosis (ACE, chymase, cathepsin G, NEP), and elastin fiber degradation (cathepsins) in stenotic aortic valves and highlighted these effectors as possible pathogenic contributors to AS. These results support the notion of AS as an active process with inflammation and extracellular matrix remodeling as its key features and identify possible new targets for medical therapy in AS.Aorttaläpän ahtauma eli aorttastenoosi on väestön ikääntyessä käynyt yhä yleisemmäksi ja merkittävän aorttaläpän ahtauman esiintyvyys yli 65-vuotiailla on 2-3%. Aorttaläpän ahtautuma johtaa lopulta sydämen vasemman kammion toiminnnan pettämiseen ja sydämen vajaatoimintaan. Taudin kulku on pitkään oireeton ja tyypilliset oireet; rasitusrintakipu, hengenahdistus ja tajuttomuuskohtaukset, ilmaantuvat vasta läppäahtauman edettyä pitkälle. Toistaiseksi aorttastenoosin etenemiseen ei ole voitu vaikuttaa lääkkeellisin keinoin ja taudin ainoana hoitona on läppäleikkaus. Tiedetään, että aorttaläpän ahtautuminen on aktiivinen prosessi, johon liittyy kolesterolin kertyminen läpän rakenteisiin sekä tulehdusta ja kalkkiutumista edistävien tekijöiden aktivoituminen. Aorttaläpän ahtauman kehittymisen mekanismit ovat kuitenkin vielä suurelta osin tuntemattomat. Tutkimustyömme keskeisenä tavoittena on ollut aorttastenoosin patogeneesin selvittäminen ja taudin etenemistä edistävien tekijöiden kartoittaminen. Tutkimusta varten kerättiin 86 aorttastenoosin vuoksi leikkaushoitoon joutuvan potilaan kattava aineisto. Kontrolliaineistona käytettiin sydämensiirroista käyttämättä jääneitä aorttaläppiä. Tutkimuksemme keskeinen ensihavainto oli, että ahtautuneissa aorttaläpissä oli runsaasti tulehdussoluperheeseen kuuluvia syöttösoluja. Toisin kuin terveissä kontrolliläpissä, joissa syöttösolut olivat lepotilassa, ahtautuneissa aorttaläpissä syöttösolut olivat aktivoituneita. Stenoottisten läppien aktivoituneet syöttösolut erittivät ympäristöönsä mm. tryptaasia, kymaasia, ja katepsiini G:tä, jotka voivat edistää läppien sidekudoskasvua ja tulehdusta. Kymaasi ja katepsiini G voivat myös aktivoida angiotensiini II:n, jolla on tärkeitä tulehdusta ja sidekudoskasvua kiihdyttäviä ominaisuuksia. Tunnetuin angiotensiini II:sta muodostava entsyymi on angiotensiinikonvertaasi eli ACE, jonka toimintaa estävät lääkkeet ovat laajalti käytössä verenpainetaudin ja sydämen vajaatoiminnan hoidossa. Tutkimuksemme tärkeä löydös oli, että aktiivista ACE:ta on aorttaläpissä ja läpän ahtautuessa ACE:n muodostus läpässä kiihtyy. ACE ja neutraali endopeptidaasi (NEP) hajottavat myös bradykiniinia, jolla on useita sydäntä suojaavia vaikutuksia. Havaitsimme, että ACE:n lisäksi myös NEP:n määrä ja aktiivisuus olivat merkitsevästi lisääntyneet stenoottisissa läpissä terveisiin kontrolliläppiin nähden. Tarkastelimme myös aorttaläppien tukirakennetta ja havaitsimme, että ahtautuneissa aorttaläpissä joustavat elastiinisäikeet olivat pilkkoutuneita ja epäjärjestäytyneitä. Löysimme aorttaläpistä elastiinia hajottavia entsyymejä, katepsiineja (katepsiini S, K, V ja G), ja osoitimme, että kyseiset katepsiinit voivat hajottaa aorttaläppien elastiinisäikeitä koeolosuhteissa. Mielenkiintoista oli, että aorttaläppien kollageeni/elastiini suhde assosioitui tupakointiin siten, että tupakoivien potilaiden aorttaläpissä oli enemmän jäykkää kollageenia ja vähemmän joustavaa elastiinia, kuin tupakoimattomilla potilailla. Osoitimme myös, että tupakansavu aktivioi syöttösoluja sekä sidekudossoluja soluviljelyolosuhteissa. Näin tupakansavu voisi suoraan aorttaläppään vaikuttamalla edistää aorttaläpän ahtauman kehittymistä. Tupakansavu myös kiihdytti ns. komplementtireseptorin, C3aR, tuotantoa aorttaläpän soluissa. Elimistön puolustusjärjestelmään kuuluvan komplementtijärjestelmän liiallinen aktivaatio voi johtaa monenlaisiin epäsuotuisiin vasteisiin ja kiihdyttää tulehdusta sekä solukuolemaa. Havitsimme, että komplementtijärjestelmä aktivoitui jo aorttaläppien alkuvaiheen stenoosimuutoksissa ja aktivaatio kiihtyi edelleen läppäahtauman vaikeutuessa. Yhteenvetona todetaan, että väitöskirjatyössä olemme selvittäneet aorttastenoosin kehittymiseen johtavia läppätason mekanismeja havainneet useita aiemmin tässä taudissa tuntemattomia tekijöitä, jotka saattavat vaikuttaa taudin kehittymiseen. Aorttaläpän ahtauman solutason mekanismien tunteminen luo mahdollisuudet ehkäisevän lääkehoidon kehittämiselle. Vaikuttamalla läppien tulehdukseen ja muihin stenoosin keskeisiin patofysiologisiin piirteisiin saatetaan tulevaisuudessa jopa hidastaa tai ehkäistä tämän taudin kehittymistä