Recovery of Yeast Saccharomyces cerevisiae after Thermal Insult

All organisms have evolved mechanisms to acquire thermotolerance. A moderately high temperature activates heat shock genes and triggers thermotolerance towards otherwise lethal high temperature. The focus of this work is the recovery mechanisms ensuring survival of Saccharomyces cerevisiae yeast cells after thermal insult. Yeast cells, first preconditioned at 37˚C, can survive a short thermal insult at 48-50˚C and are able to refold heat-denatured proteins when allowed to recover at physiological temperature 24˚C. The cytoplasmic chaperone Hsp104 is required for the acquisition of thermotolerance and dissolving protein aggregates in the cytosol with the assistance of disaccharide trehalose. In the present study, Hsp104 and trehalose were shown to be required for conformational repair of heat-denatured secretory proteins in the endoplasmic reticulum. A reporter protein was first accumulated in the lumen of endoplasmic reticulum and heat-denatured by thermal insult, and then failed to be repaired to enzymatically active and secretion-competent conformation in the absence of Hsp104 or trehalose. The efficient transport of a glycoprotein CPY, accumulated in the endoplasmic reticulum, to the vacuole after thermal insult also needed the presence of Hsp104 and trehalose. However, proteins synthesized after thermal insult at physiological temperature were secreted with similar kinetics both in the absence and in the presence of Hsp104 or trehalose, demonstrating that the secretion machinery itself was functional. As both Hsp104 and trehalose are cytosolic, a cross-talk between cytosolic and luminal chaperone machineries across the endoplasmic reticulum membrane appears to take place. Global expression profiles, obtained with the DNA microarray technique, revealed that the gene expression was shut down during thermal insult and the majority of transcripts were destroyed. However, the transcripts of small cytosolic chaperones Hsp12 and Hsp26 survived. The first genes induced during recovery were related to refolding of denatured proteins and resumption of de novo protein synthesis. Transcription factors Spt3p and Med3p appeared to be essential for acquisition of full thermotolerance. The transcription factor Hac1p was found to be subject to delayed up-regulation at mRNA level and this up-regulation was diminished or delayed in the absence of Spt3p or Med3p. Consequently, production of the chaperone BiP/Kar2p, a target gene of Hac1p, was diminished and delayed in Δspt3 and Δmed3 deletion strains. The refolding of heat-denatured secretory protein CPY to a transport-competent conformation was retarded, and a heat-denatured reporter enzyme failed to be effectively reactivated in the cytoplasm of the deletion strains.Korkea lämpötila on merkittävimpiä stressitekijöistä, joille eliöt altistuvat. Hankittu lämmönsietokyky on ilmiö, jossa esialtistus lievemmälle lämpöstressille auttaa soluja selviytymään muuten tappavan korkeista lämpötiloista. Esialtistus lisää lämpösokkiproteiinien tuotantoa soluissa, samalla kun muiden proteiinien tuotantoa vähennetään. Tässä työssä tutkittiin leivinhiivasolujen (Saccharomyces cerevisiae) palautumista voimakkaan lämpöstressin jälkeen. Lämpöstressiin liittyvät perusmekanismit ovat varsin samanlaisia eri eliöissä, joten hiivasoluilla saadut tulokset ovat merkittäviä myös monisoluisten eliöiden stressinsietotutkimuksen kannalta. Korkea lämpötila tuhoaa proteiinien oikean laskostumisen ja siten niiden toimintakyvyn. Voimakkaan lämpöstressin jälkeen hiivasolut pystyvät uudelleen laskostamaan lämmön vaurioittamia proteiineja, kun solujen annetaan palautua normaalissa kasvulämpötilassa. Hsp104 on lämmönsietokyvyn muodostumiselle välttämätön solulimassa esiintyvä lämpösokkiproteiini, joka osallistuu lämpövaurioituneiden proteiinien korjaukseen solulimassa olevan trehaloosi-sokerin avulla. Tässä työssä tutkittiin Hsp104:n ja trehaloosin merkitystä solulimakalvoston sisällä vaurioituneiden proteiinien korjaukselle. Työssä käytettiin hiivakantoja, joista toimiva Hsp104-proteiini tai trehaloosin tuotantoon tarvittava entsyymi oli poistettu. Reportteriproteiinien avulla seurattiin solujen palautumista voimakkaan lämpöstressin jälkeen normaalissa lämpötilassa. Työssä havaittiin, että toimivan Hsp104:n tai trehaloosin puuttuessa solulimakalvoston sisälle kertyneiden ja siellä lämpövaurioituneiden proteiinien korjaus estyi. Tulokset osoittavat, että soluliman proteiinikorjauskoneiston ja solulimakalvoston sisäisen proteiinikorjauskoneiston välillä on toiminnallinen yhteys. Työssä selvitettiin DNA-mikrosirukokeilla muutoksia hiivan koko genomin ilmentymisessä lämpöstressin aikana ja jälkeen. Voimakkaan lämpöstressin aikana suurin osa lähetti-RNA:sta tuhottiin. Toipumisen aikana ensimmäiseksi indusoituneet geenit liittyivät proteiinien uudelleen laskostumiseen tai proteiinisynteesin käynnistämiseen. Aineistosta valittiin jatkotutkimuksiin 30 geeniä, joista transkriptiotekijät Spt3p ja Med3p osoittautuivat merkittäviksi täyden lämmönsietokyvyn muodostumiselle ja transkriptiotekijä Hac1p:n määrän säätelylle