Novel CDNF/MANF protein family : Molecular structure, expression and neurotrophic activity

Neurotrophic factors (NTFs) are secreted proteins which promote the survival of neurons, formation and maintenance of neuronal contacts and regulate synaptic plasticity. NTFs are also potential drug candidates for the treatment of neurodegenerative diseases. Parkinson’s disease (PD) is mainly caused by the degeneration of midbrain dopaminergic neurons. Current therapies for PD do not stop the neurodegeneration or repair the affected neurons. Thus, search of novel neurotrophic factors for midbrain dopaminergic neurons, which could also be used as therapeutic proteins, is highly warranted. In the present study, we identified and characterized a novel protein named conserved dopamine neurotrophic factor (CDNF), a homologous protein to mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF). Others have shown that MANF supports the survival of embryonic midbrain dopaminergic neurons in vitro, and protects cultured cells against endoplasmic reticulum (ER) stress. CDNF and MANF form a novel evolutionary conserved protein family with characteristic eight conserved cysteine residues in their primary structure. The vertebrates have CDNF and MANF encoding genes, whereas the invertebrates, including Drosophila and Caenorhabditis have a single homologous CDNF/MANF gene. In this study we show that CDNF and MANF are secreted proteins. They are widely expressed in the mammalian brain, including the midbrain and striatum, and in several non-neuronal tissues. We expressed and purified recombinant human CDNF and MANF proteins, and tested the neurotrophic activity of CDNF on midbrain dopaminergic neurons using a 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of PD. In this model, a single intrastriatal injection of CDNF protected midbrain dopaminergic neurons and striatal dopaminergic fibers from the 6-OHDA toxicity. Importantly, an intrastriatal injection of CDNF also restored the functional activity of the nigrostriatal dopaminergic system when given after the striatal 6-OHDA lesion. Thus, our study shows that CDNF is a potential novel therapeutic protein for the treatment of PD. In order to elucidate the molecular mechanisms of CDNF and MANF activity, we resolved their crystal structure. CDNF and MANF proteins have two domains; an amino (N)-terminal saposin-like domain and a presumably unfolded carboxy (C)-terminal domain. The saposin-like domain, which is formed by five α-helices and stabilized by three intradomain disulphide bridges, may bind to lipids or membranes. The C-terminal domain contains an internal cysteine bridge in a CXXC motif similar to that of thiol/disulphide oxidoreductases and isomerases, and may thus facilitate protein folding in the ER. Our studies suggest that CDNF and MANF are novel potential therapeutic proteins for the treatment of neurodegenerative diseases. Future studies will reveal the neurotrophic and cytoprotective mechanisms of CDNF and MANF in more detail.Hermokasvutekijät ovat solun erittämiä proteiineja, jotka edistävät neuronien eloonjäämistä, kontaktien muodostumista ja säätelevät hermosolujen toimintaa. Edullisten ominaisuuksien vuoksi hermokasvutekijöitä on tutkittu mahdollisina lääkkeinä hermoston rappeumasairauksiin. Parkinsonin tauti on etenevä liikesairaus, jossa keskiaivojen mustatumakkeen dopamiinineuronit vähitellen tuhoutuvat. Tautiin ei ole olemassa hoitoa, joka pysäyttäisi neuronien tuhoutumisen tai edistäisi niiden toiminnan palautumista. Ryhmämme tutkii hermokasvutekijöitä, joista voisi olla hyötyä myös hermoston rappeumatautien hoidossa tulevaisuudessa. Tässä työssä kuvattiin uusi conserved dopamine neurotrophic factor (CDNF)-proteiini, joka on läheistä sukua aiemmin kuvatulle MANF-proteiinille. Selkärankaisten CDNF ja MANF, sekä selkärangattomien eläinten, kuten banaanikärpäsen ja sukkulamadon MANF muodostavat evoluutiossa varhain syntyneen proteiiniperheen. Osoitimme, että nisäkkäiden CDNF ja MANF ovat solusta erittyviä proteiineja, jotka ilmentyvät laajasti aivokudoksessa. Ne ilmentyvät paitsi keskiaivoissa, myös muissa aivojen osissa ja useissa hermoston ulkopuolisissa kudoksissa. Työssä tuotimme CDNF-proteiinia ja testasimme sen vaikutusta kokeellisessa Parkinsonin taudin mallissa rotilla. Rotille aiheutettiin 6-hydroksidopamiini (6-OHDA)-toksiinilla Parkinsonin tautia muistuttava vaurio. Osoitimme, että CDNF estää dopamiinineuronien tuhoutumisen, kun CDNF injisoidaan rotan aivoihin ennen toksiinia. Toisessa koesarjassa, jossa CDNF injisoitiin aivoihin neljä viikkoa toksiinivaurion jälkeen, CDNF korjasi dopamiinineuronien toimintaa ja rottien liikehäiriötä. Jälkimmäinen koeasetelma muistuttaa tilannetta Parkinson-potilailla, kun jo olemassa olevaa vauriota pyritään korjaamaan lääkehoidolla. Kokeiden perusteella CDNF saattaa olla hyödyllinen Parkinsonin taudin hoidossa. Työssä selvitimme myös CDNF- ja MANF-proteiinien molekyylirakenteen, josta on apua tutkittaessa näiden proteiinien toimintamekanismeja solussa. Rakenteen perusteella saatiin selville, että CDNF ja MANF sitoutuvat lipideihin ja mahdollisesti solumembraaneihin. CDNF:n neurotroofinen vaikutus saattaa välittyä soluun membraani-interaktion kautta. Rakenne sisältää myös rikkisillan, jonka kaltainen löytyy tietyiltä solun endoplasmisessa retikulumissa (ER:ssa) toimivilta entsyymeiltä, jotka auttavat proteiineja laskostumaan oikein. Tämä tukee muiden tutkimusryhmien raportteja, joissa osoitetaan MANF-proteiinin edistävän viljeltyjen solujen eloonjäämistä stressitilanteissa kun ER:n toiminta ja proteiinieritys ovat häiriintyneet. Rakennemallin perusteella CDNF ja MANF saattavat edistää proteiinien laskostumista ER:ssa, ja näin suojata soluja stressitilanteissa. Tutkimuksen perusteella CDNF ja MANF saattavat olla hyödyllisiä neurodegeneratiivisten sairauksien hoidossa. Jatkotutkimuksin on tarkoitus selvittää millaiset molekyylimekanismit toimivat CDNF/MANF-proteiinien soluja suojaavan ja solujen toimintaa edistävän aktiivisuuden taustalla