Quorum sensing in the plant pathogen Erwinia carotovora subsp. carotovora

Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc) is a Gram-negative enterobacterium that causes soft-rot in potato and other crops. The main virulence determinants, the extracellular plant cell wall -degrading enzymes (PCWDEs), lead to plant tissue maceration. In order to establish a successful infection the production of PCWDEs are controlled by a complex regulatory network, including both specific and global activators and repressors. One of the most important virulence regulation systems in Ecc is mediated by quorum sensing (QS), which is a population density -dependent cell-to-cell communication mechanism used by many Gram-negative bacteria. In these bacteria N-acylhomoserine lactones (AHSL), act as diffusible signaling molecules enabling communication between bacterial cells. The AHSLs are structurally diverse and differ in their acyl chain length. This gives the bacteria signaling specificity and enables the recognition and communication within its own species. In order to detect and respond to the AHSLs the bacteria use QS regulators, LuxR-type proteins. The aim of this study was to get a deeper understanding of the Ecc QS system. In the first part of the study we showed that even different strains of Ecc use different dialects and of physiological concentrations, only the cognate AHSL with the correct acyl chain is recognized as a signal that can switch on virulence genes. The molecular basis of the substrate specificity of the AHSL synthase ExpI was investigated in order to recognize the acyl chain length specificity determinants of distinct AHSL synthases. Several critical residues that define the size of the substrate-binding pocket were identified. We demonstrated that in the ExpISCC1 mutations M127T and F69L are sufficient to change the N-3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone producing ExpISCC1 to an N-3-oxooctanoyl-L-homoserine lactone (3-oxo-C8-HSL) producing enzyme. In the second study the means of sensing specificity and response to the AHSL signaling molecule were investigated. We demonstrated that the AHSL receptor ExpR1 of Ecc strain SCC3193 has strict specificity for the cognate AHSL 3-oxo-C8-HSL. In addition we identified a second AHSL receptor ExpR2 with a novel property to sense AHSLs with different acyl chain lengths. In the absence of AHSLs ExpR1 and ExpR2 were found to act synergistically to repress the virulence gene expression. This repression was shown to be released by addition of AHSLs and appears to be largely mediated by the global negative regulator RsmA. In the third study random transposon mutagenesis was used to widen the knowledge of the Ecc QS regulon. Two new QS-controlled target genes, encoding a DNA-binding regulator Hor and a plant ferredoxin-like protein FerE, were identified. The QS control of the identified genes was executed by the QS regulators ExpR1 and ExpR2 and as expression of PCWDE genes mediated by the RsmA repressor. Hor was shown to contribute to bacterial virulence at least partly through its control of PCWDE production, while FerE was shown to contribute to oxidative stress tolerance and in planta fitness of the bacteria. In addition our results suggest that QS is central to the control of oxidative stress tolerance in Ecc. In conclusion, these results indicate that Ecc strain SCC3193 is able to react and respond both to the cognate AHSL signal and the signals produced by other bacterial species, in order to control a wide variety of functions in the plant pathogen Ecc.Bakteerien välinen keskustelu johtaa kasvitautiin Kasvitaudin aiheuttavalla bakteerilla on edessään sille elintärkeä tehtävä, ravinnon saanti isäntäkasvista. Saadakseen ravintoa sen on hajotettava kasvin solukkoa. Bakteeri tietää, että yksin se ei tässä pärjää, mutta jos kavereita on tarpeeksi lähistöllä, tehtävä ei ole mahdoton. Bakteereilla on oiva tapa tähän, viestimolekyylien avulla ne huutavat toisilleen: Hei, täällä ollaan! Yksi parhaiten tunnetuista bakteerien viestimolekyyleistä on asyyli-homoseriini laktoni, jota käyttävät yli 70 eri eläin- ja kasvitaudin aiheuttajaa. Molekyylien hienosäädöllä, muun muassa asyyliketjun pituudella, bakteerit määrittävät oman viestimurteensa, jonka lähisukulaiset tunnistavat parhaiten. Näin yritetään turvata oman lajin selviäminen ympäristössä, jossa käydään kovaa kilpailua ravinnosta ja elintilasta. Bakteerin sisällä viestimolekyyli sitoutuu tunnistajaproteiiniin. Tämän seurauksena solun sisällä käynnistyy useiden geenien ilmentyminen, jotka ovat mm oleellisia taudinaiheutuskyvylle. Tunnistajaproteiini reagoi viestimolekyyleihin vasta kun niitä on suuri määrä ympäristössä. Viestin avulla bakteeri pystyy arvioimaan populaationsa tiheyden ja kun bakteereita on tarpeeksi koolla voivat nämä hyökätä menestyksekkäästi isäntänsä kimppuun. Tämän tutkimustyön kohteena oli kasvitaudin aiheuttavan bakteerin Erwinia carotovora alalajike carotovoran (Ecc) viestintäjärjestelmä. Ecc-bakteeri aiheuttaa märkämätää, muun muassa perunoille, tuottamalla suuria määriä kasvien soluseinää hajottavia entsyymejä. Näiden entsyymien valmistus on viestimolekyyleistä riippuvainen ja mikäli nämä poistetaan, katoaa bakteerien taudinaiheuttamiskyky. Eri Ecc-bakteerilajit puhuvat eri murteita, tuottaen kahta erilaista viestimolekyyliä. Tutkimuksessa tunnistettiin ne viestimolekyyliä tuottavan entsyymin rakennekivet, aminohapot, jotka vaikuttavat viestimolekyylin asyyliketjun pituuteen, eli tietyn murteen syntyyn ja pystyttiin muokkaamaan entsyymin lopputuote halutuksi. Tutkimuksen tuloksena löydettiin myös uusi tunnistajaproteiini, jolla huomattiin yllättävä kyky ymmärtää useampia murteita. Lisäksi löydettiin viestintäjärjestelmälle uusia kohdegeenejä. Yksi näistä kohdegeeneistä suojaa bakteereita happiradikaaleilta, eli oksidatiiviselta stressiltä, joka on kasvin tavallisimpia puolustusmekanismeja. Viestintäjärjestelmällä on keskeinen rooli erilaisten eläin- ja kasvitautien syntymisessä. Tämä on herättänyt kiinnostusta kehittää keinoja, joilla hiljentää bakteerien keskustelu. Tässä väitöskirjassa saadut tulokset voivat edesauttaa bioteknologisten keinojen kehitystä, joilla vaimentaa bakteerien keskustelu ja näin pysäyttää taudin syntyminen tai leviäminen