Ecological impacts of Phlebiopsis gigantea biocontrol treatment against Heterobasidion spp. as revealed by fungal community profiling and population analyses

Wood decay fungi belonging to the species complex Heterobasidion annosum sensu lato are among the most common and economically important species causing root rot and stem decay in conifers of the northern temperate regions. New infections by these pathogens can be suppressed by tree stump treatments using chemical or biological control agents. In Finland, the corticiaceous fungus Phlebiopsis gigantea has been formulated into a commercial biocontrol agent called Rotstop (Verdera Ltd.). This thesis addresses the ecological impacts of Rotstop biocontrol treatment on the mycoflora of conifer stumps. Locally, fungal communities within Rotstop-treated and untreated stumps were analyzed using a novel method based on DGGE profiling of small subunit ribosomal DNA fragments amplified directly from wood samples. Population analyses for P. gigantea and H. annosum s.l. were conducted to evaluate possible risks associated with local and/or global distribution of the Rotstop strain. Based on molecular community profiling by DGGE, we detected a few individual wood-inhabiting fungal species (OTUs) that seemed to have suffered or benefited from the Rotstop biocontrol treatment. The DGGE analyses also revealed fungal diversity not retrieved by cultivation and some fungal sequence types untypical for decomposing conifer wood. However, statistical analysis of DGGE community profiles obtained from Rotstop-treated and untreated conifer stumps revealed that the Rotstop treatment had not caused a statistically significant reduction in the species diversity of wood-inhabiting fungi within our experimental forest plots. Locally, ISSR genotyping of cultured P. gigantea strains showed that the Rotstop biocontrol strain was capable of surviving up to six years within treated Norway spruce stumps, while in Scots pine stumps it was sooner replaced by successor fungal species. In addition, the spread of resident P. gigantea strains into Rotstop-treated forest stands seemed effective in preventing the formation of genetically monomorphic populations in the short run. On a global scale, we detected a considerable level of genetic differentiation between the interfertile European and North American populations of P. gigantea. These results strongly suggest that local biocontrol strains should be used in order to prevent global spread of P. gigantea and hybrid formation between geographically isolated populations. The population analysis for H. annosum s.l. revealed a collection of Chinese fungal strains that showed a high degree of laboratory fertility with three different allopatric H. annosum s.l. taxa. However, based on the molecular markers, the Chinese strains could be clearly affiliated with the H. parviporum taxonomical cluster, which thus appears to have a continuous distribution range from Europe through southern Siberia to northern China. Keywords: Rotstop, wood decay, DGGE, ISSR fingerprinting, ribosomal DNAJuurikäävän biologisen torjunnan vaikutukset lahopuun sienilajiston monimuotoisuuteen Juurikääpien sukuun kuuluvat lahottajasienet (Heterobasidion spp.) ovat taloudellisesti merkittävin havupuiden juuri- ja tyvilahon aiheuttaja Pohjois-Euroopassa. Juurikääpätartuntoja voidaan kuitenkin estää tehokkasti hyödyntämällä juurikäävälle antagonistista harmaaorvakkasientä (Phlebiopsis gigantea), josta on Suomen oloihin kehitetty biologinen kantokäsittelyaine, Rotstop (Verdera Oy). Tämä tutkimuskokonaisuus käsittelee harmaaorvakkakäsittelyn vaikutuksia havupuun kannoissa esiintyvän sienilajiston monimuotoisuuteen. Työn puitteissa kehitettiin menetelmä, jolla ympäristönäytteiden sienilajistoa voidaan tarkastella suoraan lahosta puuaineksesta kullekin sienilajille ominaisten ribosomaalisten merkkimolekyylien (SSU rDNA) monistuksen ja DGGE-analyysin perusteella. Tutkimuksessa osoitettiin lahopuusta suoraan eristettyjen DNA-näytteiden paljastavan lajistoa, jota ei tavoitettu vertailevassa viljelyanalyysissä. Rotstopilla käsiteltyjä ja käsittelemättömiä kantoja vertailtaessa osa lajistosta näytti hyötyvän tai kärsivän käsittelystä, mutta sienidiversiteetin yleistasossa ei kuitenkaan havaittu tilastollisesti merkitsevää laskua käsitellyillä koealoilla. Harmaaorvakan osalta kantokäsittelyn vaikutuksia paikallisten populaatioiden monimuotoisuuteen tarkasteltiin havupuiden kannoista eristetyistä puhdasviljelmistä vertaillen Rotstopilla käsiteltyjä sekä käsittelemättömiä koealoja. ISSR-merkkimolekyylien perusteella voitiin todentaa Rotstop-genotyypin säilyminen kuusen kannoissa kuusi vuotta käsittelyn jälkeen sekä leviäminen myös saman koealan käsittelemättömiin kantoihin. Toisaalta Rotstop-kannan ei havaittu levinneen samoilta koealoilta viiden vuoden kuluttua käsittelystä kaadettujen puiden kantoihin. Lisäksi harmaaorvakan luontainen levintä käsitellyille koealoille näytti estävän tehokkaasti perinnöllisesti monomorfisen populaation syntymisen lyhyellä aikavälillä. Harmaaorvakkasienen lajinsisäisen muuntelun tasoa selvitettäessä havaittiin selvä maantietellinen erilaistuminen sienen eurooppalaisten ja pohjois-amerikkalaisten populaatioiden välillä. Tulosten perusteella biologiseen torjuntaan tulisi käyttää ainoastaan paikallisia harmaaorvakkakantoja, jotta voidaan välttyä geneettisen aineksen siirtymiseltä ja mahdollisten hybridikantojen muodostumiselta. Juurikäävän populaatioanalyysin perusteella voitiin osoittaa Kiinasta peräisin olevien juurikääpäkantojen kuuluvan samaan taksonomiseen ryhmään kuin eurooppalainen kuusenjuurikääpä (H. parviporum). Siten tällä patogeenilajilla näyttäisi olevan katkeamaton levinneisyys ulottuen Euroopasta Etelä-Siperian kautta aina pohjoiseen Kiinaan asti. Asiasanat: Harmaaorvakka, Rotstop, kantokäsittely, juuri- ja tyvilaho, DGGE, diversiteett