Lost in Translation : Translation Mechanisms in Production of Cocksfoot Mottle Virus Proteins

The present study focuses on the translational strategies of Cocksfoot mottle virus (CfMV, genus Sobemovirus), which infects monocotyledonous plants. CfMV RNA lacks the 5'cap and the 3'poly(A) tail that ensure efficient translation of cellular messenger RNAs (mRNAs). Instead, CfMV RNA is covalently linked to a viral protein VPg (viral protein, genome-linked). This indicates that the viral untranslated regions (UTRs) must functionally compensate for the lack of the cap and poly(A) tail. We examined the efficacy of translation initiation in CfMV by comparing it to well-studied viral translational enhancers. Although insertion of the CfMV 5'UTR (CfMVe) into plant expression vectors improved gene expression in barley more than the other translational enhancers examined, studies at the RNA level showed that CfMVe alone or in combination with the CfMV 3'UTR did not provide the RNAs translational advantage. Mutation analysis revealed that translation initiation from CfMVe involved scanning. Interestingly, CfMVe also promoted translation initiation from an intercistronic position of dicistronic mRNAs in vitro. Furthermore, internal initiation occurred with similar efficacy in translation lysates that had reduced concentrations of eukaryotic initiation factor (eIF) 4E, suggesting that initiation was independent of the eIF4E. In contrast, reduced translation in the eIF4G-depleted lysates indicated that translation from internally positioned CfMVe was eIF4G-dependent. After successful translation initiation, leaky scanning brings the ribosomes to the second open reading frame (ORF). The CfMV polyprotein is produced from this and the following overlapping ORF via programmed -1 ribosomal frameshift (-1 PRF). Two signals in the mRNA at the beginning of the overlap program approximately every fifth ribosome to slip one nucleotide backwards and continue translation in the new -1 frame. This leads to the production of C-terminally extended polyprotein, which encodes the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). The -1 PRF event in CfMV was very efficient, even though it was programmed by a simple stem-loop structure instead of a pseudoknot, which is usually required for high -1 PRF frequencies. Interestingly, regions surrounding the -1 PRF signals improved the -1 PRF frequencies. Viral protein P27 inhibited the -1 PRF event in vivo, putatively by binding to the -1 PRF site. This suggested that P27 could regulate the occurrence of -1 PRF. Initiation of viral replication requires that viral proteins are released from the polyprotein. This is catalyzed by viral serine protease, which is also encoded from the polyprotein. N-terminal amino acid sequencing of CfMV VPg revealed that the junction of the protease and VPg was cleaved between glutamate (E) and asparagine (N) residues. This suggested that the processing sites used in CfMV differ from the glutamate and serine (S) or threonine (T) sites utilized in other sobemoviruses. However, further analysis revealed that the E/S and E/T sites may be used to cleave out some of the CfMV proteins.Koiranheinän läikkäviruksen perintöaines koostuu yksisäikeisestä RNA:sta, joka voi toimia suoraan ohjeena, lähetti-RNA:na, viruksen proteiinien valmistamisessa. Koiranheinän läikkäviruksen RNA-ohjeen molemmista päistä kuitenkin puuttuvat elementit (nk. cap-rakenne ja poly(A)-häntä), jotka yleensä löytyvät solujen omista lähetti-RNA molekyyleistä ja jotka mahdollistavat niiden tehokkaan toimimisen proteiinisynteesin (translaation) ohjeistamisessa. Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään niitä mekanismeja, joilla koiranheinän läikkäviruksen RNA-molekyyli pystyy kilpailemaan proteiinisynteesikoneistosta solun omien RNA-molekyylien kanssa. Mekanismia, jota koiranheinän läikkävirus käyttää proteiinisynteesinsä aloittamiseen, tutkittiin tarkastelemalla koiranheinän läikkäviruksen RNA:n 74:n ensimmäisen nukleotidin (nk. 5'pään ei-transloitavia alue) kykyä ohjata malliproteiinin tuottoa. Tupakassa elementit, jotka olivat peräisin kaksisirkkaisia kasveja infektoivista viruksista, toimivat tehokkaimmin. Tutkituista viruksista ainoastaan koiranheinän läikkävirus infektoi yksisirkkaisia kasveja. Ohrassa vain koiranheinän läikkäviruksen elementti tehosti malliproteiinin tuottoa, viitaten mahdolliseen isäntäspesifisyyteen. Proteiinituoton nousu ei kuitenkaan aiheutunut tehostuneesta proteiinisynteesistä vaan jostain aiemmasta geeniekspression vaiheesta. Vehnänalkiouutteessa suoritetut kokeet osoittivat, että koiranheinän läikkäviruksen RNA voi ohjata proteiinisynteesinsä alkamaan myös vaihtoehtoisella mekanismilla, jossa ribosomit tarttuvat suoraan translaation aloitusta ohjaavaan elementtiin sitoutumatta ensin RNA:n alkupäähän. Kokeet ohrasoluissa kuitenkin osoittivat, että jos RNA:n päässä on cap-rakenne, proteiinisynteesin aloitus tapahtuu samalla mekanismilla kun solun omille RNA-molekyyleille on tyypillistä. Pienen kokonsa vuoksi myös virusten perimän koko on hyvin pieni ja se sisältää informaation vain rajallisen proteiinimäärän tuottamiseen. Virukset tuottavat pääsääntöisesti itse ainoastaan niitä proteiineja, joita isäntäsolulla ei ole niille tarjota. Tästä syystä positiivissäikeiset RNA virukset tuottavat itse oikeanlaisen RNA polymeraasi entsyymin, joka monistaa sen perintöaineksen. Koiranheinän läikkäviruksen kyseinen entsyymi tuotetaan nk. lukukehyksenvaihtomekanismilla. Viruksen RNA:ssa sijaitsevat signaalit pysäyttävät ja ohjaavat tietyn osan ribosomeista syntetisoimaan viruksen tarvitsemaa entsyymiä. Tutkimuksessamme havaitsimme, että koiranheinän läikkäviruksen signaalit ohjaavat noin 10-20% ribosomeista lukukehykseen, josta RNA polymeraasi tuotetaan. Huomasimme myös, että koiranheinän läikkävirus tuottaa proteiinia, joka näyttää estävän lukukehyksen vaihtumisen. Tämä viittaa siihen, että saavutettuaan tietyn pitoisuuden kyseinen proteiini saattaa pysäyttää viruksen RNA polymeraasin tuoton. Koiranheinän läikkävirus tuottaa osan proteiineistaan yhtenä suurena polyproteiinina, joka pilkotaan toimiviksi yksittäisiksi proteiineiksi viruksen tuottaman proteaasi-entsyymin toimesta. Pilkkomista säätelee polyproteiinissa olevat alueet, jotka leikkaava proteaasi tunnistaa erilaisilla tehokkuuksilla. Tästä johtuen, pilkkomisen akana syntyy välituotteita, joiden ominaisuudet voivat erota lopputuotteista. Tämä on yksi tapa, jolla virukset voivat lisätä perintöaineksensa koodauskapasiteettia. Tutkimuksessa selvitettiin koiranheinän läikkäviruksen tuottaman proteaasin ominaisuuksia tutkimalla millaisia väli- ja lopputuotteita viruksella infektoiduista kasveista löytyy. Yksi proteaasin polyproteiinista tunnistama alue saatiin selville määrittämällä viruspartikkeleihin viruksen RNA:n mukana pakattavan proteiinin aminohapposekvenssi. Tutkimuksen perusteella huomattiin, että koiranheinän läikkäviruksen polyproteiinin pilkkomiseen käytettävät tunnistusalueet eroavat niistä sekvensseistä, joita muut sobemovirukset sekä läheiset sukulaisvirukset käyttävät. Tulevaisuuden tavoitteena on saavutetun tiedon avulla löytää mahdollisuuksia vaikuttaa hyödyllisellä tavalla isäntä- ja transgeenien ilmentymiseen kasveissa