Lihan pilaantumisen kannalta merkittävien maitohappobakteerien 16S rRNA geenin V3 alueen monistumiserojen mittaaminen reaaliaikaisella PCR-menetelmällä

PCR-pohjaisissa viljelystä riippumattomissa menetelmissä geenin monistumistehokkuuden eroavuudet voivat aiheuttaa epätarkkuutta mikrobiyhteisöstä saatuun kuvaan. Tässä tutkimuksessa arvioitiin 16S rRNA -geeniin sitoutuvan universaalin alukeparin soveltumista lihan pilaantumisen kannalta merkittävien maitohappobakteerien tutkimiseen reaaliaikaisella PCR-menetelmällä. Työssä tutkittiin yhteensä 36 maitohappobakteerien tyyppi- ja referenssikantaa Carnobacterium-, Enterococcus-, Lactobacillus-, Lactococcus-, Leuconostoc- ja Weissella-suvuista. Maitohappobakteerien lisäksi tutkittiin Brochothrix thermospacta -lajin tyyppi- ja referenssikantaa. Bakteerikannat kasvatettiin MRS- tai TS-elatusaineilla anaerobisissa olosuhteissa. DNA:n eristykseen käytettiin muokattua Pitcherin menetelmää. Templaatti-DNA:n laatu ja konsentraatio määritettiin spektrofotometrisesti. PCR-monistus tehtiin reaaliaikaisella kapillaarilaitteella (LightCycler®) SYBR Green –kemiaa käyttäen, jolloin PCR-tuotteen muodostumista voitiin seurata ajon aikana. Monistuksessa käytettiin HDA1/HDA2 –alukeparia, jossa HDA1-alukkeeseen oli kiinnitetty GC-häntä. Kunkin ajon jälkeen LightCycler™ ohjelmisto ilmoitti kullekin reaktiolle kynnysarvon (Cp, crossing point). Lisäksi ajo-ohjelma suoritti sulamiskäyräanalyysin kullekin tuotteelle. Lopuksi PCR-tuotteet ajettiin vielä etidiumbromidilla värjätyssä agaroosigeelissä. Templaatit monistuivat käytetyillä alukkeilla hyvin ja agaroosigeelielektroforeesin perusteella kustakin kannasta saatiin odotetun kokoinen PCR-tuote. Kynnysarvot vaihtelivat eri lajeilla 9,9:stä 18,5:een. Myös saman lajin eri kantojen kynnysarvot poikkesivat toisistaan, mutta erot eivät olleet aivan yhtä suuria kuin tarkasteltaessa kaikilta lajeilta saatuja arvoja. Brochothrix thermospacta -kannat ja Weissella-suvun kannat monistuivat tehokkaimmin, Carnobacterium- ja Enterococcus-sukujen kannat heikoimmin. Kuten oli odotettavissa, GC-hännällisistä tuotteista muodostui kaksi sulamispistettä. Alempi sulamispiste havaittiin lämpötila-alueella 80,5-84,2 °C ja ylempi lämpötila-alueella 83,7-90,7 °C. Lactobacillus-suvussa alempien sulamispisteiden lajien väliset vaihtelut olivat suurimmat, Weissella- ja Enterococcus-suvuissa pienimmät. Tutkitulla alukeparilla maitohappobakteerien monistumisen kynnysarvot poikkesivat viitaten amplifikaatiotehokkuuksien eroihin. Tästä johtuen populaatiota kuvaavaan sormenjälkeen saattaa muodostua epätarkkuuksia, mitä tullaan jatkossa tutkimaan DGGE-menetelmällä