Evaluación enológica de co-inoculación de levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces en vinos chilenos

Tradicionalmente la fermentación alcohólica del mosto se producía de forma espontánea, a partir de levaduras nativas presentes en las propias uvas. De esta fermentación tradicional espontánea se consiguen obtener vinos poco reproducibles, con un elevado riesgo de presentar alteraciones microbiológicas y químicas y con unos tiempos de fermentación más largos. Para conseguir asegurar un buen término de la fermentación, haciendo uso de la microbiología, se comenzaron a utilizar inóculos de fermentación, utilizando levaduras seleccionadas por su buena capacidad fermentativa consiguiendo no solo asegurar el término de la fermentación, sino que además confiriendo al vino unas características deseadas. Posteriormente aparecieron las levaduras secas activas (LSA) usadas como inóculos puros. Se observó que el uso continuado de una misma cepa comercial en bodega daba lugar a la obtención de vinos muy reproducibles, todos ellos con una cierta similitud organoléptica, no pudiendo obtener un producto claramente diferenciable. En la actualidad el sector del vino se encuentra en una situación cada vez más competitiva y globalizada, es por ello que los productores de vino se enfrentan a una necesidad de mejorar las características organolépticas de sus vinos para satisfacer las necesidades del mercado. Por su parte los enólogos se enfrentan al reto de mejorar el proceso fermentativo y obtener una mayor complejidad aromática, lo que se traduce en una demanda de nuevas y mejores cepas de levadura capaces de adaptarse a diferentes tipos y estilos de vino. Esta demanda se puede solventar mediante la selección de levaduras no-Saccharomyces, ya que presentan potencial para formar compuestos volátiles. Durante el proceso de fermentación alcohólica las levaduras convierten los azúcares en etanol y dióxido de carbono, pero además producen metabolitos volátiles que, siendo minoritarios, determinan fundamentalmente las características aromáticas del vino. El perfil aromático del vino es el resultado de la combinación e interacción existente entre los distintos compuestos aromáticos, aunque su aroma genérico es atribuido mayoritariamente a alcoholes y ésteres, que le otorgan su calidad e intensidad aromática. Las levaduras no- Saccharomyces son capaces de crear perfiles aromáticos más complejos en el vino mediante la generación de enzimas, β-glucosidasas, que permiten la liberación de moléculas de terpeno y tiol. Por ello estas levaduras con baja tolerancia a la presencia de etanol, son utilizadas en cultivos iniciadores mixtos o secuenciales junto con una levadura Saccharomyces para la obtención de vino. Mediante el uso de los cultivos iniciadores mixtos o secuenciales se consigue obtener un vino con características específicas según la levadura no-Saccharomyces utilizada en la fermentación, por ello en busca de poder diferenciar un vino de otro se realiza el presente proyecto que se encuentra englobado en uno de mayor amplitud en el que se desea evaluar la contribución de dos levaduras nativas chilenas no-Saccharomyces sobre el mejoramiento del perfil aromático del vino en microfermentaciones, tanto en vino tinto como en blanco. El principal objetivo que se persigue en este proyecto es realizar la fermentación con una inoculación secuencial o co-inoculación, primero de una levadura nativa chilena no-Saccharomyces seguida de una levadura Saccharomyces cerevisiae sobre un mosto Sauvignon Blanc del valle de Limari en Chile. Las levaduras nativas escogidas para este estudio son: - Levadura nativa 1: código PNLI29 desde Limari identificada como Lachancea thermotolerans. - Levadura nativa 2: código SB1MP3 desde Maipo identificada como Hanseniospora uvarum. Para asegurar una correcta fermentación se realiza un seguimiento del contenido en etanol mediante un kit enzimático específico y también un seguimiento de las poblaciones de levaduras por conteo en cámara de Neubauer al microscopio. Para tener una referencia de una fermentación con la que poder comparar los datos que se van obteniendo se van a realizar dos controles de fermentación con levaduras comerciales ambos dos. El primer control será una fermentación con una co-inoculación de Torulaspora delbrueckii, levadura no- Saccharomyces comercial con una Saccharomyces cerevisiae. El segundo control será una fermentación únicamente utilizando como levadura Saccharomyces cerevisiae. Una vez ha finalizado la fermentación, con el fin de garantizar que son las levaduras inoculadas las presentes en las distintas fases de la fermentación, y por tanto que han sido capaces de fermentar el mosto, se va a proceder a realizar los siguientes tratamientos a las muestras que se van recogiendo durante todo el periodo de producción de vino: Extracción de ADN mediante el Power Soil DNA Isolation kit (MO-BIO Laboratories, Inc.), que consiste en una extracción mecánica seguida de una química. La mecánica es llevada a cabo por medio de unas piedrecitas (silicatos o vidrio) que son las encargadas de romper las membranas y paredes, para posteriormente agregar reactivos que permitan la precipitación de paredes y membranas para poder aislar el ADN, extracción química. Posteriormente se realiza una amplificación del ADN extraído mediante la reacción en cadena de la polimerasa, PCR (Polymerase Chain Reaction). Es un procedimiento que permite amplificar una secuencia de ADN deseada. La amplificación por PCR posibilita la detección específica de secuencias de ADN, haciendo posible la identificación de microorganismos contaminantes. La amplificación se alcanza mediante un proceso cíclico, de entre 25 y 40 ciclos. La última de las técnicas moleculares utilizadas para la identificación de microorganismos es la determinación del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). Consiste en la diferenciación de los microorganismos mediante el análisis de los patrones de ruptura generados en un lugar específico del genoma del organismo, cuando es cortado mediante las endonucleasas o enzimas de restricción. Los fragmentos polimórficos que aparecen son debidos a que los organismos de diferentes especies, e incluso de distintas cepas, difieren en la distancia de los sitios de clivaje para cada enzima de restricción (Ratón, 2004). Los resultados obtenidos tanto para la PCR como para el RFLP son comparados en geles de poliacrilamida por medio de electroforesis, método analítico con el que se logran separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa, todo bajo la acción de un campo eléctrico. Se van a realizar 4 tratamientos, levadura nativa 1, levadura nativa 2 y los dos controles. Cada uno de los tratamientos se ha replicado 3 veces, con lo que se van a tener un total de 12 microfermentaciones en tubos Falcon de 50 ml de capacidad. Partiendo de las condiciones de contenido en azúcares, acidez total y sulfuroso libre y total iniciales del mosto se procede a la primera inoculación de levaduras en los tubos que contienen 50 ml de mosto, y que van a llevar a cabo la primera parte de la fermentación. A las 48 horas de haber iniciado la fermentación se co-inoculan los 9 tubos que contienen levaduras no-Saccharomyces con la levadura Saccharomyces cerevisiae comercial, para llevar a término la fermentación, ya que es capaz de aguantar niveles superiores de etanol que las no-Saccharomyces. Una vez finaliza la fermentación se procede a analizar las muestras que se han ido recogiendo correspondientes a los días 1, 3, 6 y 8 de fermentación. Mediante el seguimiento realizado del contenido en etanol y de la población de levaduras se ha comprobado que la fermentación realizada por las levaduras nativas ha sido correcta y con unos valores similares a los obtenidos en los controles de fermentación. Para poder asegurar que no ha habido una contaminación con algún otro microorganismo y que han sido las levaduras inoculadas las que han llevado a cabo la fermentación se lleva a cabo la extracción de ADN, la amplificación de las regiones espaciadoras trascritas internas (5.8S-ITS) y la determinación del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción, es decir, la digestión de las amplificaciones del ADN extraído. Mediante el revelado de geles de poliacrilamida en los que se han insertado las muestras junto con positivos que corresponden al ADN extraído de las levaduras utilizadas, con las que se van a comparar las amplificaciones y digestiones obtenidas, observando que efectivamente las levaduras escogidas para realizar el estudio han sido las que han fermentado el mosto. Una vez confirmado que las levaduras nativas escogidas son aptas para realizar un proceso de fermentación de un mosto de uva blanca, resta realizar un análisis del perfil aromático del vino obtenido con las microfermentaciones, estudio que será realizado por un enólogo experto, y por otro lado se ha de realizar el mismo estudio con un mosto de uva tinta, para observar si las levaduras nativas se comportan de manera similar