Arabidopsis thaliana como modelo de estudio de la coevolución planta-virus

El efecto negativo que causan los patógenos sobre las eficacias biológicas de sus huéspedes se denomina virulencia. Como consecuencia de este efecto, los huéspedes han desarrollado mecanismos de defensa para evitar o limitar el daño producido por los patógenos. Estos mecanismos de defensa de los huéspedes reducen a su vez la eficacia biológica de los patógenos. Por tanto, los mecanismos de virulencia y de defensa imponen presiones de selección recíprocas sobre las poblaciones de los huéspedes y los patógenos. Así, los patógenos evolucionarán para generar nuevos mecanismos de virulencia que les permitan eludir las defensas de los huéspedes. A su vez, los huéspedes evolucionaran para generar nuevas defensas más eficaces frente a los nuevos mecanismos de virulencia de los patógenos. Esta “carrera de armamentos” pueden originar un proceso coevolutivo, definiendo coevolución como el cambio genético adaptativo recíproco en dos o más poblaciones. Para que se de coevolución huésped-patógeno han de cumplirse las siguientes condiciones: 1) variación genética de los caracteres relevantes para la interacción huésped patógeno, como la virulencia y las defensas, 2) la interacción huésped-patógeno ha de depender de la naturaleza de los genotipos del huésped y del patógeno, 3) los caracteres implicados en la interacción deben tener efectos recíprocos en las eficacias biológicas de las dos poblaciones y 4) deben producirse cambios temporales en las frecuencias de los genotipos en las poblaciones de huésped y patógenos. La coevolución huésped-patógeno se acepta comúnmente aunque la evidencia que la demuestra es limitada, sobretodo en interacciones planta-virus. La evidencia de coevolución tiene que derivarse de un sistema silvestre en el que no haya existido, ni exista, manipulación humana sobre la población del huésped o del patógeno. Por ello, en esta tesis se analiza la coevolución planta-virus en el patosistema silvestre compuesto por el huésped Arabidopsis thaliana y el virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV). El análisis de la incidencia de cinco virus en cinco poblaciones silvestres de A. thaliana de la Meseta Central de la Península Ibérica durante 9 años, demostró que el virus de mayor incidencia es CMV. Además, la incidencia de CMV fue máxima en las primeras fases del ciclo vital de las plantas, y las infecciones por CMV en los estados iniciales del desarrollo del huésped son más graves. Por ello, CMV podría ser un factor importante en la evolución de las poblaciones de A. thaliana y por tanto un patógeno adecuado para analizar si hay evidencia de coevolución planta-virus. Los mecanismos de defensa más importantes de las plantas a los virus son la resistencia y la tolerancia. Para analizar la variabilidad de la resistencia y la tolerancia a CMV de A. thaliana, condición necesaria para que exista coevolución, se seleccionaron 12 poblaciones silvestres de A. thaliana de la Península Ibérica de las cuales se muestrearon 10 individuos al azar y se analizó su respuesta a la infección por dos aislados de CMV en dos ambientes diferentes. La resistencia y la tolerancia a CMV se cuantificaron como la acumulación viral y el efecto de la infección sobre la producción de semillas, respectivamente. En los dos ambientes, la resistencia y la tolerancia de A. thaliana a CMV variaron genéticamente entre individuos y poblaciones. Además, la resistencia y la tolerancia a CMV dependieron de la interacción del genotipo del huésped y del patógeno. Por tanto, estos resultados son compatibles con una hipótesis de coevolución A. thaliana-CMV ya que verifican dos de las condiciones necesarias para que se de coevolución huésped-patógeno. Para analizar si los dos caracteres de defensa se encuentran bajo selección se estimó y comparó el coeficiente de diferenciación genética para caracteres cuantitativos (QST) y el coeficiente de diferenciación genética para marcadores neutrales (FST). Los valores de QST de la resistencia y de la tolerancia a CMV en los dos ambientes fueron inferiores a los valores de FST, lo que indica que la diferenciación genética de la resistencia y la tolerancia a CMV entre poblaciones es menor de lo esperado por el azar, resultado compatible con que estén bajo selección. Además, la diferenciación genética para los marcadores neutrales sigue a un patrón de aislamiento por distancia, lo que no ocurre con la diferenciación genética de la resistencia ni la tolerancia a CMV. Por tanto, los dos caracteres de defensa de A. thaliana a CMV están bajo selección uniforme y la evolución favorece una mayor diversidad genética de ambos caracteres dentro que entre las poblaciones. La variabilidad genética de un carácter, y por tanto su evolución, puede estar relacionada con la variación de factores ambientales. También, cabe la posibilidad de que los caracteres de defensa de A. thaliana a CMV estén ligados a otros caracteres cuya variación genética esté condicionada por factores ambientales distintos de la infección por virus. Por todo ello, se analizó la relación entre la variación de la resistencia y de la tolerancia a CMV de 77 individuos de A. thaliana de la Península Ibérica y diferentes factores del medio abiótico de las localizaciones de origen de los individuos. Los resultados indicaron que la variación de las dos defensas a CMV de A. thaliana no estaba relacionada con la de los factores del medio abiótico, a diferencia de otros caracteres de la historia vital de la planta en ausencia de infección por CMV. Además, la resistencia y la tolerancia a CMV, no están relacionadas con la estructura genética de A. thaliana en la Península Ibérica. En consecuencia, la variabilidad genética de la resistencia y la tolerancia a CMV de A. thaliana no está determinada por la adaptación de la especie al medio abiótico, y por tanto este resultado es compatible con que la selección a la que están sometidos ambos caracteres de defensa se debe a la infección por CMV. Por último se analizó si diferentes aislados de CMV procedentes de A. thaliana están adaptados a su huésped, lo que puede ser evidencia de la evolución de estos aislados para contrarrestar las defensas de A. thaliana. Para ello se comparó un conjunto de aislados de CMV procedentes de A. thaliana y otro procedente de especies de cucurbitáceas, que se inocularon en 21 individuos de A. thaliana de diferentes poblaciones de la Península Ibérica y en melón. Los resultados indicaron que los aislados de A. thaliana se multiplicaron mejor en A. thaliana que los de cucurbitáceas y los aislados de cucurbitáceas se multiplicaron mejor en melón que en A. thaliana. Además, el análisis de la secuencia de nucleótido de los genomas de estos aislados indicó una estructuración genética según su huésped de origen. Todos estos resultados indican adaptación a huésped en CMV, y apoyan la hipótesis de evolución de CMV en respuesta a las defensas de A. thaliana. Por tanto, los resultados de esta tesis verifican varias de las condiciones necesarias para que se de coevolución planta-virus en el sistema A. thaliana-CMV. ABSTRACT Pathogen infection results in damage to the host, which can be quantified as a reduction of the host fitness. Hosts have developed different defence strategies to avoid or limit pathogen infection. As host defences may reduce the fitness of the pathogen, host and pathogen may co-evolve, defining co-evolution as the process of reciprocally adaptive genetic change in two or more populations. Four conditions should be met for host-pathogen coevolution: 1) genetic variation in the relevant host and pathogen traits; 2) dependence of the outcome combination of host and pathogen genotypes involved; 3) reciprocal effects of the relevant traits of the interaction on the fitness of the host and the pathogen and 4) changes in genotype frequencies in both the host and the pathogen populations. It is currently assumed that hosts and pathogens co-evolve, but there is surprisingly little evidence in the case of plant-virus interactions. Evidence for plant-virus co-evolution would require the analysis of systems in which the host might evolve in response to virus infection, i.e. virus–host systems involving wild hosts in natural ecosystems. Therefore, in this thesis, Arabidopsis thaliana was chosen as a host and Cucumber mosaic virus as a pathogen to approach the analysis of plant-virus coe-volution in a natural ecosystem. The incidence of five viruses in five wild populations of A. thaliana in Central Spain was monitored over nine years to determine the role of viral infections on the population dynamics of A. thaliana. CMV was the virus with the highest incidence, which CMV was maximal when the most, or a large fraction, of plants in the populations, were at the primary stages of development, in which CMV infections are most negative for A. thaliana’s fitness. These results suggest that CMV infection could be a selection force on the analysed A. thaliana populations and that the wild system A. thaliana-CMV is a good one to seek evidence of plant-virus co-evolution. The most important defence mechanisms of plants against their viruses are resistance and tolerance. To determine the variation of resistance and tolerance of A. thaliana to CMV, ten randomly sampled individuals from 12 wild populations were assayed for their resistance and tolerance to infection by two isolates of CMV in two environmental conditions. Resistance was estimated as viral accumulation and tolerance as the effect of viral infection on seed production. Results showed evidence of genetic variation of resistance and tolerance to CMV within and between populations, and this variation was higher within than between populations. In addition, resistance and tolerance depended on the specific virus genotype x host genotype interaction. Therefore, these results are compatible with the hypothesis of plant virus co-evolution, because they show evidence for two of the conditions required for hostpathogen co-evolution. To determine if the two defence characters are under selection, genetic differentiation for the quantitative traits of resistance and tolerance to CMV was estimated between populations (QST) and compared with genetic differentiation for neutral markers (FST). QST for resistance and tolerance to CMV were significantly lower than FST in two environmental conditions, suggesting that both characters are under selection. In addition, the significant correlations detected between FST and geographic distances indicated the presence of a geographic pattern derived from the demographic history of these populations. By contrast, these populations did not show a significant pattern of isolation by distance when comparing QST values for resistance or tolerance to CMV. Therefore, resistance and tolerance of A. thaliana to CMV are under uniform selection and evolution favours greater genetic variation of both characters within populations than between populations. It is possible that the genetic variation and evolution of traits can be related to variation of environmental factors such as temperature or precipitation. Resistance and tolerance of A. thaliana can also be related to environmental factors or other traits in which genetic variation is related to environmental factors apart from viral infections. To explore these possibilities, the relationship between phenotypic variation of resistance and tolerance to CMV and abiotic factor variation was analysed for 77 geo-referenced individuals of A. thaliana from the Iberian Peninsula. Results indicated that resistance and tolerance of A. thaliana to CMV were not related to the abiotic factors analysed. However, other life history traits of uninfected plants were related to these factors. Also, neither defence mechanism was related to the genetic structure of the species in the Iberian Peninsula. Consequently, the genetic variation of resistance and tolerance of A. thaliana to CMV is not determined by plant adaptation to abiotic factors, and therefore this result is compatible with the hypothesis that CMV infection could be the selection force acting on resistance and tolerance. Finally, we have analysed if different genotypes of CMV isolated from A. thaliana are adapted to their host, which can be evidence of evolution of these isolates in response to A. thaliana’s defences. For this, two groups of CMV isolates, one from A. thaliana and another from cucurbit crops, were compared. All CMV isolates were inoculated into 21 individuals of A. thaliana from different populations of the Iberian Peninsula and into melon. Results indicated that the accumulation of CMV isolates from A. thaliana was higher in A. thaliana than in melon; and the accumulation of CMV isolates from cucurbits was higher in melon than in A. thaliana. Furthermore, the analysis of nucleotide sequences from CMV isolates indicated that CMV isolates are clustered depending on their original host. All these results suggest that CMV isolates are adapted to their host, supporting the hypothesis of CMV evolution in response to A. thaliana’s defences. Consequently, all the results of this thesis confirm several of the necessary conditions for plant-virus co-evolution in the A. thaliana-CMV system