Studies on localization mechanisms of the maternal pos-1 mRNA in Caenorhabditis elegans embryos

多くの多細胞生物において、受精直後の初期発生は主として母性遺伝子によって制御されている。母性遺伝子の産物は母性mRNAや母性タンパク質の形で卵母細胞に蓄えられ、特定の時期に、特定の割球で機能を発現して個々の細胞に独自の性質を与える。この母性遺伝子の時空間的発現制御機構の一一つとしてmRNAの局在化が多くの動物で観察されており、母性遺伝子の発現制御上、重要な働きをしている事が示唆されているが、その詳細な機構については不明な点が多い。 本研究では線虫の母性mRNAであるpos-1mRNAの局在化機構の解明を目指した。母性胚性致死遺伝子であるpos-1遺伝子のmRNAは卵母細胞内には一様に分布するが、受精後第一卵割中に後極へ局在化を始める。線虫では生殖細胞系譜へ局在化する母性mRNAが他にも知られているが,それらmRNAの多くは4細胞期以降に局在を開始しており,pos-1mRNAの局在にはそれらとは異なる独自の制御機構が働いている事が期待される。また、pos一1タンパク質はpos-1mRNAの局在開始と同じ時期に発現し始め、その発現が後極に局在していることから、pos-1m剛Aの局在はpos-1タンパク質の局在をも制御している事が期待される。 本研究を始めるにあたり、まず10一15匹程度の線虫を対象とした再現性の高い少数胚in site hybridizationのプロトコルを確立した。本研究ではRNAを顕微注入した個体等、ごく少数のサンプルを解析したため、少数の胚を再現性良く染色出来るin site hybridizationのプロトコルの確立は必要不可欠であった。 続いて、シス因子解析のために内在性pos-1mRNAの局在パターンを再現出来るin vivo assay系を構築する事にした。このn vivo assay系として,まずin vitroで合成したレポーターRNA(タグ配列と検討対象の3\u27UTRなど遺伝子配列を含む)を顕微注入し、その後の局在パターンをin site hybridizationで調べる方法を試みた。この結果、レポーターRNAはpos-1の3\u27UTR依存的に分解されるという意外な現象を見出した。レポーターRNAの分解はpos-1 3\u27UTRに特異的な現象で、また、レポーターRNAの分解はNMD経路に依存しなかった.これらの結果と、レポーターRNAの分解がpos-1mRNAの局在化や翻訳が開始する1細胞期中に起こる事から、レポーターRNA分解活性は内在性pos-1mRNAの転写後調節の一端を反映している事が示唆されたが、しかし、胚全体で1細胞期に分解される点は内在性pos-1mRNAの挙動と違っており,この系では内在性pos-1mRNAの局在パターンを再現出来なかった。 次にin vivo assay系として試したのが、形質転換体にタグ配列とpos-1配列の融合mRNAを発現させ、その局在パターンをin site hybridizationで調べる方法である。通常、線虫で外来遺伝子を母性発現させる事は困難なため,まず、外来遺伝子を母性発現させる事に適した形質転換法のbiolistictransformation法を習得した。また、biolistic transformation法は効率が悪く,時間がかかる事で知られていたが、条件検討を行い、世界的に見ても非常に高い効率で形質転換体を獲得出来る条件を見つけた。さらに、初期胚でmRNAの存在量が多い事が知られているpos-1遺伝子のpromoterを利用した、発現量の多い母性発現用プラスミドを開発し、従来の発現プラスミドでは発現量の少なさから不可能だった,内在性pos-1mRNAの局在パターンの再現を可能にした。以上の技術開発を行った後,形質転換体を用いる方法が内在性のpos-1mRNAの局在パターンを再現出来るか調べるため、GFP::pos-1 3\u27UTR融合mRNAを発現する形質転換体を獲得したところ、GFP融合mRNAは2細胞期には生殖細胞系譜へ局在化しており、この系では内在性pos-1 mRNAの局在パターンを再現出来る事が分かった。その後の解析で、GFP融合mRNA上の他の配列(SL1、pos-1 5\u27UTR,GFP、3\u27Linker配列)にはGFP融合mRNAの局在化に十分な活性が無い事、pos-13\u27UTR配列はGFP融合mRNAの局在化に必要な事が分かった。以上の結果から、この形質転換を用いる方法がin vivo assay系としてpos-1mRNAの局在化活性の評価に使える事が分かった。また、pos-1mRNAの局在化において3\u27UTR配列が主要な制御配列として働いている事が強く示唆された。 そこで、次にこのin vivo assay系を用いてpos-1 3\u27UTRによる局在化制御機構についてくわしく調べる事にした。pos-1 3\u27UTRに対してdeletion解析を行った結果、3\u27UTRの後半122ntを欠失させると局在化活性が失われる事、前半140ntを欠失させても内在性pos-1mRNAと同様に局在化する事が分かった。 更に比較ゲノム科学的な観点からもpos-1 3\u27UTRを解析した。近縁線虫のC.briggsaeとC.elegansの間ではpos-1 3\u27UTR配列が保存されている事が知られており、C.briggsaeの3\u27UTRもmRNAの局在化活性を示す事が期待された。そこで、C.briggsaeの内在性pos-1mRNAの局在について調べた所、C.briggsaeにおいてもpos-1 mRNAはC.briggsae同様・生殖細胞系譜へ局在化している事が分かった。また、C.briggsaeにGFP::cb pos-1 3\u27UTR融合mRNAを発現させた所,この融合mRNAはC.briggsaeの内在性pos-1mRNA同様の局在パターンを示した。この事はC.elegansとC.briggsaeの間で,pos-1mRNAの局在化シス因子が保存されている事を強く示唆している。C.elegansにおいてmRNAの局在に必要な事が分かった3\u27側の122ntの領域には種間で完全に保存された30ntの配列が存在しており、この配列内にmRNA局在化制御のシス因子が存在する事が期待される。 トランス因子については、母性致死、母性不妊変異体の内、RNA結合タンパク質をコードする事が知られているものを対象とした小規模なスクリーニングを行い、mex-5,mex-5;mex-6変異体で初期胚におけるpos-1mRNAの局在が異常になる事が分かった。初期胚において、MEX-5タンパク質はpos-1遺伝子産物とは逆に体細胞系譜へ局在化する。この時期、体細胞系譜ではpos-1mRNAが分解されており、MEX-5タンパク質はpos-1 mRNAの分解を直接,又は間接的に制御してpos-1mRNAを局在させていると考えられる。