Mecanismos de acción de la insulina en la represión de la transcripción : el gen de la 5-aminolevulinato sintetasa como modelo experimental

La insulina desempeña un papel clave en la regulación de múltiples procesos celulares. La unión de la hormona a su receptor en la superficie celular activa la actividad intínseca de quinasa de tirosinas del mismo, ocasionando la autofosforilación del receptor y la fosforilación de sustratos intracelulares denominados IRSs. Los IRSs actúan como moléculas adaptadoras en la transducción de señales, reclutando a una gran variedad de proteínas que contienen dominios de homología Src (SH2), entre ellas: la subunidad regulatoria (p85) de la PI3K a la “growth factor receptor binding protein 2”(Grb2). Este evento conduce a la activación de las cascadas de la PI3K y de Ras/MAPK, respectivamente. En el presente trabajo hemos examinado la acción de la hormona peptídica sobre la expresión del gen de la 5-aminolevulinato sintetasa (ALAS) en hepatocitos de rata y en células de hepatoma humano HepG2. La ALAS es la primera enzima y regulatoria de la biosíntesis del hemo, su nivel es normalmente bajo en el hígado pero se incrementa marcadamente en respuesta a drogas porfirinogénicas como el fenobarbital. El tratamiento con insulina 5nM produjo una notable disminución en los niveles del mRNA de ALAS tanto en condiciones basales como de estimulación con fenobarbital. Este efecto fue dosis dependiente como pudo observarse mediante ensayos de Northern y slot blot. Por otra parte la vida media del mRNA de ALAS no fue modificada por la presencia de la hormona lo que sugiere que la acción ejercida por la insulina sería relevante a nivel transcripcional. Con la finalidad de determinar la actividad transcripcional del promotor, realizamos una construcción (pACAT) que contiene 876 pb de la región 5’ flanqueante del gen de ALAS dirigiendo la expresión de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). En cotransfecciones transientes de células HepG2 observamos una significativa disminución de la actividad CAT cuando se incubaron las células con la hormona. Considerando estos resultados, utilizamos dos metodologías diferentes para caracterizar las vías de transducción de señales involucradas en la represión hormonal de ALAS. En un primer abordaje empleamos agentes químicos, permeables a la membrana plásmatica, que inhiben específicamente a proteínas intermediarias de la señalización de insulina, para evaluar la contribución de estos efectores a la respuesta final. Los inhibidores de la PI3K (wortmanina y LY294002), de la famesilación de Ras (lovastatina y PD152440) y de MEK (PD98059) abolieron la acción de la insulina, mientras que el inhibidor de mTOR/p70RSK (raparnicina) no tuvo efecto alguno sobre la represión hormonal. Por otra parte, analizamos el efecto de la sobrexpresión de formas dominantes negativas o constitutivamente activas de intermediarios de las vías de Ras/MAPK y de la PI3K para evaluar el papel de estas cascadas en la inhibición transcripcional de ALAS. La cotransfección de células HepG2 con versiones dominantes negativas de SOS, Ras, Raf, MEK y MAPK interfirió la acción de la insulina, mientras que la cotransfección con formas constitutivamente activas de Ras, MEK y p90RSK mimetizó la inhibición hormonal per se, independientemente del estímulo en el receptor. Un comportamiento similar se obtuvo cuando empleamos versiones dominantes negativas de PI3K y PKB o a la PKB miristoilada, respectivamente. Estos resultados nos permiten proponer que la señalización a través de ambas vías es requerida para obtener la totalidad del efecto final. Por último, la regulación hormonal fue mediada por un fragmento de ll7 pb (-469/354) del gen de ALAS, capaz de conferir sensibilidad a insulina cuando fue subclonado río arriba del promotor heterólogo de la quinasa de tímidina (pALIRE). Esta región presenta la secuencia GTTTTG, muy similar al IRE canónico reportado para genes reprimidos por la insulina, que resultó crucial para la inhibición. En EMSAs pudo observarse la formación de complejos por unión a secuencias con alta homología a las de HNF3 y NF1 presentes en esta región. Todos estos hallazgos sugieren que la insulina requiere la acción orquestada de efectores celulares (intermediarios de las cascadas Ras/MAPK/p90RSK y PI3K/PKB) y de factores de transcripción que reconocen secuencias específicas y abre la posibilidad de considerar que miembros de las familias HNF3 y NF1 podrían intervenir en la respuesta