Production of antigens and antibodies of veterinary interest in tobacco transplastomic plants

En esta Tesis Doctoral, se evaluó la factibilidad de utilizar plantas transplastómicas de tabaco (Nicotiana tabacum) para la producción de proteínas de interés en medicina veterinaria: dos antígenos virales y un anticuerpo de camélido de cadena simple (VHH). La primera proteína producida en este sistema consistió en una fusión entre un epítope inmunogénico de la proteina VP1 del virus de la fiebre aftosa y la enzima β-glucuronidasa (VP-βGUS). Se generaron plantas transplastómicas, las cuales fueron caracterizadas a nivel molecular. La proteína heteróloga se acumuló de un modo importante en los cloroplastos de las plantas transformadas: hasta el 51% de las proteínas solubles totales (PST) (8 mg/g de tejido fresco [TF]), conservando su actividad enzimática e inmunogenicidad. Los niveles de expresión observados resultaron claramente mayores a los obtenidos previamente en plantas transgénicas nucleares utilizando la misma construcción. A pesar de estos altos niveles de expresión, el fenotipo de las plantas transplastómicas resultó ser indistinguible del de las plantas wild-type. Esta prueba de concepto con resultados alentadores nos permitió avanzar en la producción de otras moléculas mediante este sistema. El segundo antígeno expresado fue VP8*, una proteína no glicosilada de la cápside de rotavirus bovino (RVB). Se utilizó una versión del vector que permite la acumulación de VP8* en el estroma y se generaron dos construcciones adicionales, una para expresarla como una fusión a la β-glucuronidasa (GUS-E-VP8*), y otra para dirigirla al lúmen de los tilacoides (str- VP8*). VP8* se acumuló como agregados insolubles en el estroma de los cloroplastos y pudo ser solubilizada parcialmente por sonicación. Se obtuvieron extractos de VP8* utilizando la fracción soluble, donde VP8* representaba el 4% de las PST (250 μg/g TF). Al extraerse VP8* a partir de la fracción insoluble sin incluir el paso de sonicación, fue posible enriquecer la preparación en la proteína recombinante, eliminar la nicotina, y mejorar el rendimiento al obtenerse 500 μg/g TF. La proteína VP8* obtenida a partir de ambas fracciones resultó ser inmunogénica y protectiva contra el virus en el modelo del ratón lactante. Las estrategias alternativas para la expresión de VP8* no fueron exitosas. GUS-E-VP8* se acumuló como una proteína soluble en el estroma del cloroplasto, pero en niveles significativamente menores que VP8*. La construcción str-VP8* permitió la translocación de VP8* al lúmen de los tilacoides, pero se observó una proteólisis no esperada de la proteína, y la presencia de una forma truncada de la misma. Estos resultados sugieren que la acumulación de VP8* en el estroma del cloroplasto es favorecida por su insolubilidad, que la protegería del ataque proteolítico. La tercera molécula expresada fue el VHH clon 3B2 dirigido contra un epítope conformacional de la proteína VP6 de RVB. Para la expresión de este nanoanticuerpo también se evaluaron tres estrategias: expresión de VHH en el estroma, redirección al lúmen de los tilacoides (pep- VHH) y fusión a la enzima β-glucuronidasa (GUS-E-VHH). Todas las líneas de plantas transplastómicas expresando VHH mostraron un fenotipo heteroplástico. El análisis molecular confirmó la heteroplastía en líneas que habían sido regeneradas en medio selectivo al menos tres veces. La proteína VHH se acumuló en niveles bajos, los cuales se acercaban al límite de la detección por la técnica de western blot. La expresión se mejoró significativamente tanto en las plantas pep-VHH (2,5% de las PST; 60 μg/g TF) como en las GUS-E-VHH (3% de las PST; 70 μg/g TF), aunque en este último caso se observaron productos de degradación. Las plantas pep-VHH homoplásticas tenían un fenotipo clorótico que se intensificaba con la mayor iluminación. Los resultados obtenidos muestran la dificultad de expresar este VHH en cloroplastos y sugieren un efecto tóxico del transgén. La redirección al lúmen de los tilacoides favorecería la estabilidad de esta proteína heteróloga, lo cual es consistente con su expresión exitosa en E. coli cuando se expresa en el periplasma bacteriano. Los resultados presentados en este trabajo aportan evidencias que promueven el uso y optimización de plantas transplastómicas como biorreactores, para llegar a ser alternativas rentables y concretas de uso en la industria