Voltage-gated potassium currents of the trigeminal ganglion - relevance to chronic orofacial pain

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017A sobrevivência de um organismo depende em grande parte da sua capacidade de perceção de estímulos que possam comprometer a integridade dos seus tecidos possibilitando respostas de fuga ou de proteção. Esta competência é assegurada pelos mecanismos de nocicepção que são iniciados nas terminações periféricas dos nociceptores, fibras nervosas especializadas na transdução de estímulos químicos, físicos ou térmicos potencialmente nocivos. Os corpos celulares dos nociceptores que enervam a maior parte do corpo encontram-se reunidos ao longo da espinal medula nos gânglios da raiz dorsal (DRG, do inglês Dorsal Root Ganglion) enquanto que os das fibras que transduzem os estímulos nociceptivos da maioria dos tecidos craniofaciais têm os seus corpos celulares no gânglio trigeminal (TG, do inglês Trigeminal Ganglion). Devido ao seu elevado limiar de ativação, apenas estímulos de grande intensidade são capazes de ativar estes neurónios. Quando este limiar é atingido, a ativação de canais iónicos especializados leva à despolarização da membrana e à geração de um potencial de ação que é propagado ao longo do axónio do nociceptor até ao seu terminal central. Este faz sinapse com neurónios de segunda ordem na espinal medula que, por sua vez, transmitem a informação às estruturas cerebrais responsáveis pela integração da informação nociceptiva no contexto cognitivo e emocional, dando origem à experiência que conhecemos como “dor”. Apesar do seu importante papel fisiológico, em algumas situações, a dor deixa de ser um sinal de alarme para o potencial ou efetivo dano de tecidos, prolongando-se para lá do intervalo necessário para o processo de regeneração (geralmente é considerado um período de 3 meses). Nestes casos, a dor torna-se crónica e passa a ser ela própria uma patologia caracterizada pela presença de dor espontânea, hiperalgesia (os estímulos dolorosos passam a invocar uma sensação mais intensa), alodínia (estímulos que não eram dolorosos passam a sê-lo), parestesias (sensações anormais) e disestesias (sensações anormais e dolorosas). Quando a dor crónica afeta a região orofacial, o seu impacto torna-se ainda mais negativo devido à importância da cara e cabeça na formação da autoestima. São exemplo das síndromes que afetam esta região a enxaqueca, disfunções temporomandibulares, a neuralgia trigeminal e a dor facial idiopática. Para além dos episódios de dor que podem tornar-se muito frequentes ou mesmo constantes, as complicações associadas incluem anorexia, náuseas, fotofobia e fonofobia. Desta forma, não só o bem-estar físico fica comprometido como também o estado psicológico e vida social dos doentes são seriamente afetados. Em casos extremos estes transtornos estão também relacionados a um elevado risco de suicídio. A dor crónica afeta 20% da população tendo grandes efeitos socioeconómicos. Contudo, ainda existe uma lacuna no que diz respeito ao conhecimento dos fenómenos patofisiológicos subjacentes, fator que resulta em tratamentos não são totalmente eficientes e ligados a efeitos secundários como a habituação e a dependência. Esta falha é ainda mais profunda no que diz respeito à dor orofacial uma vez que a maior parte dos modelos animais utilizados se concentra no estudo dos membros inferiores, devido à maior facilidade no que diz respeito ao acesso cirúrgico e aos procedimentos de teste comportamental. Por trás da dor crónica estão mediadores químicos libertados pelos tecidos danificados e em situações de inflamação. Estas moléculas são responsáveis pela ativação de cascatas de transdução de sinal que culminam tanto em alterações funcionais rápidas como em alterações de longo termo ao nível da expressão genética. Uma das classes moleculares cuja expressão e função é afetada são os canais de potássio dependentes de voltagem (KV). Estas proteínas membranares são ativadas por alterações no potencial de membrana e o fluxo de potássio por elas mediado é responsável pela repolarização da membrana durante os potenciais de ação. A família de canais KV é extremamente diversa pelo que, além desta função, estes canais também estão envolvidos na regulação da excitação neuronal, do limiar de ativação, da forma do potencial de ação, da frequência de disparo, entre outros. Desta forma, alterações nas propriedades biofísicas destes canais irão refletir-se no nível de excitabilidade neuronal. O foco da presente dissertação são os nociceptores que enervam a região orofacial e as alterações sofridas pelos canais KV num contexto de dor orofacial crónica. Para estudar estas modificações foi estabelecido um modelo animal através da injeção de uma emulsão de detritos bacterianos ativadora do sistema imunitário, o CFA (do inglês Complete Freund’sAdjuvant), na região perioral de ratos Wistar machos (N=3). Durante 28 dias o comportamento dos ratos foi monitorizado para avaliação da presença de alterações sensoriais. Os testes comportamentais incluíram a observação e quantificação de comportamentos espontâneos bem como a medição da sensibilidade mecânica da pele em redor das vibrissas. Embora a alterações observadas nos comportamentos espontâneos não tenham sido significativas, foi observada uma tendência que será explorada em trabalhos futuros. Não obstante, a existência de perturbações sensoriais foi confirmada pela redução do limiar de sensibilidade mecânica da zona mistacial. Após 4 semanas, os animais foram sacrificados e os TG foram recolhidos para experiências de whole-cell voltage-clamp. Em condições controlo, as correntes registadas são caracterizadas por duas componentes: uma de inativação mais rápida (IFast) e outra de inativação mais lenta (ISlow). A caracterização eletrofisiológica destas componentes em n = 34 neurónios de TGs provenientes de ratos naïve revelou a existência de duas populações que diferem nas expressões relativas de cada componente, uma descoberta que está de acordo com a literatura referente a TG e a DRG. Geralmente as correntes de potássio são consideradas um “travão” da excitabilidade neuronal. No entanto, os resultados desta dissertação sugerem que numa situação de dor orofacial crónica estas correntes são potenciadas. Por um lado, a inativação da componente ISlow está comprometida o que contribui para a potenciação da repolarização da membrana na fase final do potencial de ação, permitindo que um padrão de disparo frequente e repetitivo seja sustentável. Por outro lado, a componente IFast ativa-se a potenciais de membrana mais despolarizados, i.e., durante o potencial de ação a ativação destes canais ocorre mais tardiamente. Estes resultados, associados a uma inativação mais lenta da componente ISlow indicam que os potenciais de ação propagados ao longo dos nociceptores são mais longos do que os da situação controlo, o que terá consequências ao nível da transmissão sináptica para o sistema nervoso central. Tendo em conta resultados obtidos em experiências anteriores e o facto de as alterações observadas se concentrarem na componente lenta, foi também estudada a contribuição da subunidade KV1.3 que se suspeita estar envolvida na patofisiologia da dor crónica (resultados não publicados) e medeia uma corrente cuja cinética está de acordo com os resultados obtidos. Outro conjunto de resultados importantes está incluído na comparação entre as correntes observadas em neurónios do TG e neurónios dos DRG. Não só não foram detetadas diferenças significativas ao nível das correntes controlo, mas também as alterações observadas no contexto de dor orofacial crónica são concordantes com os resultados obtidos em modelos de dor nas patas traseiras. Deste modo, pode admitir-se que a dor orofacial crónica partilha alguns mecanismos com a dor crónica noutras regiões corporais o que poderá ser explorado no desenvolvimento de futuros fármacos. Deste modo, no presente trabalho estabeleceu-se que 1) a injeção de CFA na região perioral dá origem a perturbações sensoriais de longa duração (28 dias); 2) no contexto de dor orofacial crónica as correntes de potássio sofrem modificações que permitem uma situação de atividade neuronal exacerbada mantendo a homeostasia, podendo também estar envolvidas em mecanismos de sensibilização do sistema nervoso central e 3) é possível que alguns mecanismos envolvidos no estabelecimento da dor orofacial crónica estejam também implicados no desenvolvimento da dor crónica noutras regiões corporais, representado possíveis alvos terapêuticos.The perception of noxious environmental stimuli is essential for protection and survival. Along with cognitive and emotional brain processing, the nociceptive input gives rise to the complex experience known as “pain”. The noxious mechanical, chemical, and thermic stimuli are transduced by specialised neurones, the nociceptors, whose cell bodies are found in the dorsal root ganglia (DRG) and the trigeminal ganglion (TG). These afferent fibres synapse to second-order neurones in the dorsal horn of the spinal cord, which in turn project to the higher centres responsible for eliciting the consciousness of pain. When pain persists for longer than 3 months, the period considered necessary for tissue regeneration, it becomes chronic and no longer serves its biological purpose. This condition is characterised by spontaneous pain, hyperalgesia (painful stimuli evoke a more intense response), allodynia (innocuous stimuli become painful), paraesthesias (abnormal sensations), and dysesthesias (painful paraesthesias). The orofacial region is the site of several chronic pain syndromes such as migraine, temporomandibular disorders, trigeminal neuralgia, and persistent idiopathic facial pain. Associated with these disorders, there is a loss of quality of life that often manifests in depression. Due to the lack of knowledge about the mechanisms underlying these conditions, the available treatments are not effective and are associated with unpleasant side effects such as habituation and addiction. Chronic pain conditions are characterized by an augmented neuronal excitability induced by mediators released during injury and inflammatory conditions. Central to the setting of neuronal excitability is the voltage-gated potassium (KV) channel family. These membrane proteins are responsible for the regulation of resting membrane potential, action potential threshold, shape, firing frequency, and adaption. The focus of the present dissertation was the KV-mediated currents of small-diameter neurons from the TG, where the cell bodies of the fibres innervating the craniofacial region are found. These currents were characterised both in naïve and chronic pain conditions. Additionally, the currents obtained from TG neurons of naïve animals were compared with the currents from DRG neurons, the “spinal analogue” of the TG. An animal model for chronic inflammatory orofacial pain was established through subcutaneous administration of complete Freund’s adjuvant (CFA) to the whisker pad of male Wistar rats (N=3). The degree of nociceptive disturbance was evaluated both by changes in the spontaneous behavioural activity and the withdrawal threshold upon mechanical stimulation. The results show that following CFA injection, the animals displayed signs of altered nociception and increased sensibility lasting up to 28 days. Despite the lack of significant differences in spontaneous behaviours, suggestive tendencies were observed. After the 4 weeks period, the rats were euthanised and the TG neurons were dissociated and used for whole-cell voltage-clamp recordings. The electrophysiological results suggest that in a chronic pain condition the KV currents (traditionally viewed as a neuroexcitability “brake”) are surprisingly intensified. The inactivation of the slower current component is compromised and its kinetics is even slower in the chronic pain model. Moreover, the fast current component is activated at more depolarized membrane potentials. Thus, it can be concluded that in the context of chronic orofacial pain KV currents are modified allowing for an exacerbated neuronal activity while maintaining a homeostatic mechanism Furthermore, the altered KV currents may be involved in the long-term sensitization of the central nervous system. The results also suggest the existence of shared mechanisms between orofacial chronic pain and chronic pain in other body regions since no significant differences were found in the biophysics of KV currents of both TG and DRG neurones. Additionally, the changes observed in this chronic pain model are consistent with previous findings in models focused in the hind paw. Furthermore, the presence and function of KV1.3, a channel subunit formerly implicated in the pathophysiology of chronic pain (unpublished results), was confirmed. In conclusion, the present dissertation suggests new mechanisms underlying chronic orofacial pain hinting at possible new therapeutic approaches