Infeção invasiva por Haemophilus influenzae: caracterização fenotípica e molecular e estudo da virulência de estirpes isoladas em Portugal

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Haemophilus influenzae é um microrganismo responsável por infeções invasivas graves no Homem, apesar de ser frequentemente encontrado como colonizador do trato respiratório. Este agente patogénico é dinâmico e a sua epidemiologia tem vindo a mudar desde a introdução da vacina nos anos 90. Até à data, foram identificados 6 tipos capsulares (a-f), apesar de a maioria das estirpes caracterizadas atualmente serem não capsuladas (HiNC). Estudos anteriores caracterizaram a doença invasiva em Portugal, entre 1989-2001 e entre 2002-2010. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotípica e molecularmente os isolados clínicos de doença invasiva em Portugal, durante um período de 6 anos (2011-2016), e comparar os resultados obtidos com os de estudos realizados anteriormente, bem como identificar a presença/ausência de 6 dos fatores de virulência destas estirpes. Durante o período de estudo considerado foram analisadas 174 estirpes invasivas, provenientes de 32 hospitais. A cápsula e o serotipo capsular foram identificados e caracterizados através de amplificação por PCR. A produção de β-lactamase foi pesquisada com nitrocefin, e a suscetibilidade aos antibióticos foi determinada pelo método da microdiluição em placa, de acordo com as diretrizes do European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). De modo a avaliar a relação genética entre os isolados, foi realizada a técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST), para amplificar e sequenciar os fragmentos internos dos 7 genes ‘housekeeping’ – adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi, e recA. O sequence type (ST) foi atribuído através da base de dados de MLST para H. influenzae (https://pubmlst.org/hinfluenzae/), e as distâncias alélicas entre os STs foram representadas através da análise do algoritmo goeBURST, na plataforma PHYLOViZ. A presença/ausência dos fatores de virulência pilA, ompP5, hmw1A/hmw2A, hifA, e hia foi determinada por amplificação por PCR. As estirpes HiNC foram as principais responsáveis por doença invasiva (143/174; 82%); no entanto, 31 estirpes (31/174; 17,8%) eram capsuladas e foram caracterizadas como: 4 do serotipo a (2,3%), 21 do serotipo b (12,1%), 2 do serotipo e (1,1%), e 4 do serotipo f (2,3%). A maior parte das estirpes eram suscetíveis aos antibióticos estudados, com 12% (21/174) de estirpes resistentes à ampicilina por produção de β-lactamase. O MLST foi realizado para 136 estirpes e revelou elevada variabilidade genética entre 106 HiNC, com 71 STs diferentes (71/106; 67%). Pelo contrário, as estirpes capsuladas eram clonais: Hib-ST6 e ST-190, Hia-ST23, Hie-ST18, e Hif-ST124. Em Portugal, as estirpes HiNC suscetíveis aos antibióticos e apresentando elevada diversidade genética são as principais responsáveis pela doença invasiva a H. influenzae, apesar de estirpes Hib ainda circularem numa percentagem considerável no nosso país. Estirpes do serotipo não-b têm vindo a emergir, após a introdução da vacina contra o Hib, nomeadamente os serotipos a e f. Os fatores de virulência estudados, essenciais na fase de adesão ao hospedeiro, não se encontram obrigatoriamente em todas as estirpes e a sua presença não está associada a uma maior gravidade da infeção. No entanto, eventos como recombinação genética, ou variação de fase, estão entre os fatores que mais contribuem para o fitness do microrganismo, aquando da colonização da nasofaringe, contribuindo para uma maior patogenicidade, principalmente das estirpes HiNC. Devido à sua dinâmica evolutiva, é necessária a continuação da vigilância da doença invasiva a H. influenzae em Portugal, para que se possam desenvolver estratégias de prevenção adequadas.Haemophilus influenzae is an important pathogen, responsible for invasive disease, despite being one of the most common upper respiratory tract colonizers. This pathogen is dynamic and its epidemiology has been changing since vaccine introduction in 1990s. Six capsular types (a-f) have been identified, although now most characterized strains are non-capsulated (HiNC). Previous studies have characterized invasive isolates recovered in Portugal, between 1989-2001 and 2002-2010. We aim to phenotypically and molecularly characterize invasive isolates recovered in Portugal, over a 6-year period (2011-2016), compare these results with the previous ones, and identify the presence/absence of 6 selected virulence factors. During the study period, as part of a laboratory-based surveillance system, we received 174 invasive isolates, from 32 different Portuguese hospitals. Capsular status and serotype was identified and characterized by PCR amplification. β-lactamase production was assessed with nitrocefin, and antibiotic susceptibility was determined by the microdilution assay, according to the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) guidelines. To assess genetic relatedness among isolates Multilocus Sequence Type (MLST) was performed by amplifying and sequencing internal fragments of the 7 housekeeping genes – adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi, and recA. Sequence type (ST) was assigned at https://pubmlst.org/hinfluenzae/, and the allelic distances between the STs were displayed using goeBURST analysis, through PHYLOViZ platform. The presence/absence of the virulence factors pilA, ompP5, hmw1A/hmw2A, hifA, and hia was determined by PCR amplification. Invasise disease was mainly due to HiNC strains (143/174; 82%); 31 isolates (17.8%) were capsulated and characterized as follows: 4 serotype a (2.3%), 21 b (12.1%), 2 e (1.1%), and 4 f (2.3%). Most strains were susceptible to antibiotics, with 12% (21/174) being β-lactamase producers. MLST, performed for 136 isolates, revealed high genetic variability among 106 HiNC isolates, with 71 different STs (67%). Capsulated isolates were clonal: Hib-ST6 and ST-190, Hia-ST23, Hie-ST18, and Hif-ST124. In Portugal, invasive disease is predominantly due to susceptible, highly genetically diverse HiNC strains, although Hib strains are still circulating in the country. Non-b serotype strains have also been emerging, after Hib vaccine introduction. The 6 studied virulence factors, which are important for adherence to host cells, are not necessarily found in all strains, nor are associated with a higher level of infection. Genetic recombination events and phase variation are among the factors that contribute to the overall fitness of the pathogen, mainly among HiNC strains. Due to its evolving dynamics, ongoing surveillance is needed, in order to better understand the burden of the disease and develop appropriate public health prevention strategies