A face química da interação patogénico-hospedeiro: mecanismo da resposta ao stress oxidativo

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017As proteínas flavodiférricas (FDP’s) são uma família de enzimas que estão associadas a processos de destoxificação de oxigénio e/ou espécies reativas de azoto (RNS), por esse motivo pretendeu-se com este trabalho compreender o papel de uma proteína flavodiférrica de classe A presente no genoma do organismo Clostridium difficile P28 no metabolismo destas espécies. Este estudo torna-se importante pelo fato que no processo de infeção, o Clostridium difficile se depara com vários stresses entre os quais oxidativo (oxigénio no meio do hospedeiro) e nitrosativo, proveniente do sistema imunitário do hospedeiro, e este enzima pode ser uma das possíveis vias para que o organismo possa sobreviver face a ambientes hostis. Foi realizada a caracterização bioquímica da proteína de interesse bem como dos seus possíveis parceiros de redução (rubredoxina de alto peso molecular (HMW-Rd) e rubredoxina (Rd)), bem como a avaliação da sua atividade especifica no metabolismo de diferentes substratos, nomeadamente oxigénio, óxido nítrico e peroxido de hidrogénio. Determinou-se que o enzima FDP se encontra no estado tetrâmero apresentando dois ferros e uma flavina por proteína, tendo sido determinado um tamanho por monómero de aproximadamente 44kDa e estimou-se um potencial de redução da flavina de +70 mV e +30 mV apresentando uma semiquinona vermelha. Após se ter obtido um mecanismo reacional para a redução do FDP avaliou-se a sua atividade especifica para os diferentes substratos obtendo-se uma atividade especifica para o oxigénio de 0.43s-1, para o óxido nítrico de 0.114 s-1 e de 0.06 s-1 para o peroxido de hidrogénio. Deste modo pode concluir-se que o enzima apresenta atividade para os três substratos testados, podendo apresentar uma contribuição na eliminação do stress oxidativos e nitrosativo.Flavodiiron proteins (FDPs) are a family of enzymes that are associated with detoxification processes of oxygen and / or reactive nitrogen species (RNS). In this work, the role of a class A flavodiiron protein present in the genome of the pathogenic bacterium Clostridium difficile P28 will be studied. This study becomes important because during the infection process, Clostridium difficile faces various stresses including oxidative and nitrosative, namely from the host's immune system. Therefore, this enzyme may be one of the possible pathways for the bacteria to survive in hostile environments. The biochemical characterization of the protein of interest as well as of its possible redox partners (high molecular weight rubredoxin, HMW-Rd, and rubredoxin, Rd), as well as the evaluation of its specific activity in the metabolism of different substrates, namely oxygen, nitric oxide and hydrogen peroxide was performed It was determined that the FDP enzyme is in the tetrameric state having two irons and one flavin per monomer, a size per monomer of approximately 44kDa having been determined and a potential of reducing the flavin of +70 mV and +30 mV having a red semiquinone was estimated. After obtaining a reaction mechanism for the reduction of the FDP its specific activity was evaluated for the different substrates obtaining a specific activity for oxygen of 0.43s-1, for the nitric oxide of 0.114s-1 and for the hydrogen peroxide 0.06s-1. In this way, we conclude that the enzyme has activity for the three substrates tested, and may contribute to the elimination of oxidative and nitrosative stress