Revisão dos métodos de obtenção de células não neuronais para o estudo da fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica ao nível molecular in vitro

PURPOSE: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that displays a rapid evolution. Current treatments have failed to revert clinical symptoms because the mechanisms involved in the death of motoneuron are still unknown. Recent publications have put non-neuronal cells, particularly, astrocyte and microglia, in the scenario of pathophisiology of the disease. Animal models for ALS, particularly transgenic mice expressing the human SOD1 gene with a G93A mutation (hSOD1), are available and display the phenotype of the disease at cellular and clinical levels. However, it is a lack of detailed information regarding the methods to study the disease in vitro to better understand the contribution of non-neuronal cells in the onset and progression of the pathology. METHODS: Colonies of Swiss mice and transgenic mice expressing hSOD1 mutation as well as non-transgenic controls (wild-type) were amplified after a genotyping evaluation. Disease progression was followed behaviorally and mortality was registered. Highly purified primary cultures of astrocytes and microglia from mouse spinal cord were obtained. Cells were identified by means of GFAP and CD11B immunocytochemistry. The purity of astroglial and microglial cell cultures was also accompanied by means of Western blot and RT-PCR analyses employing a number of markers. RESULTS: The disease onset was about 105 days and the majority of transgenic mice displayed the disease symptoms by 125 days of age and reached the endpoint 20 days later. A substantial motor weakens was registered in the transgenic mice compared to wild-type at the end point. Immunocytochemical, biochemical and RT-PCR analyses demonstrated a highly purified primary cultures of spinal cord astrocytes and microglia. CONCLUSION: It is possible to achieve highly purified primary cultures of spinal cord astrocytes and microglia to be employed in cellular and molecular analyses of the influence of such non-neuronal cells in the pathophysiology of ALS.OBJETIVO: A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal com evolução rápida. Os tratamentos atualmente disponíveis falham em reverter os sintomas porque os mecanismos envolvidos na morte do neurônio motor ainda não são conhecidos. Publicações recentes colocam as células não neuronais, particularmente o astrócito e a microglia, no cenário da fisiopatologia da doença. Modelos animais para a ELA, particularmente os camundongos transgênicos que expressam o gene da SOD1 humana (hSOD1) mutante estão disponíveis e mostram o fenótipo da doença ao nível celular e clínico. Entretanto, informações detalhadas são escassas sobre os métodos de estudo da doença in vitro para a melhor compreensão da participação das células não neuronais no início e na progressão da patologia. MÉTODOS: Colônias de camundongos Swiss e camundongos transgênicos que expressam a hSOD1 mutante assim como os controles não transgênicos (selvagem) foram amplificadas após avaliação genotípica. A progressão da doença foi acompanhada pelo comportamento e a mortalidade foi registrada. Culturas primárias altamente purificadas de astrócitos e microglia da medula espinal dos camundongos foram obtidas. As células foram identificadas pela immunocitoquímica da GFAP e CD11B. A pureza das culturas de astrócitos e microglia foi acompanhada pelas análises do Western blot e RT-PCR empregando-se marcadores específicos. RESULTADOS: Os primeiros sinais da doença ocorreram por volta dos 105 dias de vida e a maioria dos camundongos transgênicos já estava com a doença manifestada aos 125 dias de idade e alcançaram o estágio terminal aproximadamente 20 dias depois. Fraqueza substancial da força muscular foi registrada nos animais transgênicos comparados com os animais selvagens. Análises imuncitoquímica, bioquímica e pelo RT-PCR demonstraram culturas primárias altamente purificadas de astrócito e microglia da medula espinal dos camundongos. CONCLUSÃO: É possível obter culturas purificadas de astrócitos e microglia da medula espinal do camundongo a ser empregadas em análises celulares e moleculares da influência destas células não neuronais na fisiopatologia da ELA.FAPESPCNP