Development of human 3D in vitro test systems for the risk assessment of nanomaterials

Die Nanotechnologie stellt eine der Schlüsseltechnologien dieses Jahrhunderts dar Parallel zur Erschließung neuer Möglichkeiten, die die Nanotechnologie bietet, müssen jedoch auch mögliche Risiken untersucht werden. Die dabei zurzeit noch am häufigsten eingesetzte Untersuchungsmethode von Nanopartikeln ist die Verwendung zweidimensionaler in vitro Zellkulturen. Zum Einsatz kommen hier jedoch meist Zelllinien. Die Versuchsansätze entsprechen damit nicht den Bedingungen im menschlichen Körper. Eine der in vivo Situation nähere und damit exaktere in vitro Untersuchungsmöglichkeit des Risikopotentials stellt der Einsatz dreidimensionaler Zell-Testsysteme dar. Mit diesen Modellen lassen sich die Strukturen von Körperbarrieren in vitro nachbilden, nanoskalige Partikel toxikologisch untersuchen und so die Ergebnisse auf den menschlichen oder tierischen Organismus übertragen. Insbesondere im Bereich der Nanotoxikologie ist die Verifizierung einer möglichen Penetration und Absorption der Partikel durch die Körperbarrieren wichtig. Der Respirationstrakt und die Haut stellen dabei wesentliche potentielle Eintrittspforten für Nanopartikel dar. In dieser Arbeit wurden daher humane Luftröhre und Haut als dreidimensionale in vitro Testsysteme aufgebaut, um eine mögliche Toxizität von Nanomaterialien zu untersuchen. Für den Aufbau des dreidimensionalen Hautmodells wurden sowohl primäre humane Keratinozyten und Fibroblasten, als auch die Keratinozyten-Zelllinie HaCaT eingesetzt. Parallel wurden vergleichende Studien an zweidimensionalen Zellkulturen durchgeführt, da sie im Bereich der Nanotoxikologie bislang noch als Standardtestsysteme eingesetzt werden. Diese zeigten deutliche Unterschiede zwischen den eingesetzten Keratinozyten und der Zelllinie HaCaT. Bei der Zelllinie konnte nur Interleukin 8 als Entzündungsmarker gemessen werden, während primäre Zellen, neben Interleukin 8 auch Interleukin 6, den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), sowie das Monozyten Entzündungsprotein 1alpha (MIP-1alpha) sezernierten. Damit wiesen die primären Zellen eine eindeutig höhere Reaktion bzw. verbesserte Zell-Zell-Kommunikation auf, als die Zelllinie HaCaT. Versuche an dreidimensionalen Hautmodellen zeigten keine erkennbare Penetration der Partikel, die sich als Agglomerate auf der Hornschicht absetzten. Die Zelllinie zeigte jedoch im Vergleich eine überschießende Stressreaktion auf die Nanopartikel. Neben der Haut stellt der Respirationstrakt eine sehr wichtige Körperbarriere in Bezug auf die Nanotoxikologie dar. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war daher der Aufbau eines 3D in vitro Tracheamodells. Durch die Neuentwicklung und Optimierung eines Differenzierungsmediums ließen sich primäre Zellen in 2D-Zellkulturen gezielt zur Ausbildung funktioneller Zilien anregen, die für die mucoziliäre Reinigungsfunktion der Trachea essentiell sind. Gleichzeitig wurde ein Bioreaktor entwickelt, mit dem sich zum einen die Zellkultur mit Nährmedium versorgen, zum anderen aber auch die Respiration nachstellen lässt. Gleichzeitig waren tracheaspezifische Marker für schleimproduzierende Becherzellen, zilientragende Epithel-Zellen, sowie Tight Junctions nachweisbar. Erste nanotoxikologische Versuche mit dem 3D-Tracheamodell zeigten keine relevanten Tendenzen. Klassische Untersuchungsmethoden zur Nanotoxizität sind jodoch zum einen nur auf Monolayer-Kulturen ausgelegt und zum anderen im Bereich der Nanotoxikologie nicht anwendbar. Kohlenstoffbasierte Nanopartikel interagieren mit den Proteinen aus den Assays und erzeugen dadurch falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse. Ein Teilaspekt dieser Arbeit war daher die Etablierung neuer Methoden zur Testung der Nanotoxizität, so konnte die globale Genexpressionsanalyse an primären Keratinozyten untersucht werden. Bereits bei der Untersuchung eines Viertels des Transkriptoms waren Unterschiede der Expressionsmuster der behandelten Proben und der Referenz erkennbar. Spezifische Marker der Keratinozyten, die für die Ausbildung der schützenden Hornschicht zuständig sind, wurden grundsätzlich bei den mit Nanomaterialien behandelten Proben herabreguliert. Die Zellen, die mit Titandioxid in Kontakt gebracht wurden, zeigten zusätzlich im Vergleich zu den mit Carbon Black oder Carbon Nanotube behandelten Zellen eine Einschränkung der Zellproliferation, sowie Adhäsion. Bei den mit Carbon Nanotube behandelten Zellen konnten Genexpressionsmuster identifiziert werden, die für eine Einschränkung des Zellzyklus und ein Defizit in der Quervernetzung von Kollagenstrukturen sprechen. Als weitere Untersuchungsmethode zur Untersuchung der Nanotoxizität wurde die nichtinvasive Raman-Spektroskopie eingesetzt. Mit ihr konnten nach der Behandlung der 3D-Hautmodelle mit den verschiedenen Nanomaterialien bereits unterschiedliche Reaktionen der Zellen nachgewiesen werden. Die globale Genexpressionsanalyse und die Raman-Spektroskopie sollten daher als innovative Werkzeuge für die Nanotoxikologie weiterentwickelt werden.The nanotechnology is one of the key technologies of the 21th century. It shows a great potential for the development of new products in the material science but also in the field of health care. Parallel to the chances, potential risks have to be further investigated. The most current investigation method is the use of two-dimensional in vitro cell cultures. However cell lines are used for these studies, partially primary cells are also applied. Indeed, these tests do not correspond to the conditions in the human body. Hence, a more exact in vitro investigation of the risk potential is the application of three-dimensional test systems. With these models body barrier structures can be simulated in vitro and can be examined the nanoscaled particle toxicology. Particularly in the area of nanotoxicology the verification of a possible penetration and absorption of the particles through the body barriers is important. Hence, in this work the human skin and the human airtube were built up as three-dimensional in vitro test systems and the possible toxicity of nanomaterials were examined. Comparative studies were carried out with two-dimensional cell cultures of HaCaT and primary keratinocytes. Tests with two-dimensional cell cultures showed clear differences between keratinocytes and the HaCaT. The cell line could only produce interleukin 8 as an inflammation marker, whereas the primary cells, besides interleukin 8, also showed the expression of interleukin 6, the granulocyte colony-stimulation factor (GCSF) as well as the monocyte inflammation protein 1alpha (MIP-1alpha). Tests with the 3-D skin models showed no recognizable penetration of the particles which are distributed as an agglomerate on the cornified layer. The inflammation markers interleukin 6 and 8 could be identified as specific markers in the skin models. The respiratory tract has also an important barrier function. Hence, another main focus was the construction of a three-dimensional in vitro trachea model. In monolayer cultures primary cells could be stimulated to proliferation and by the development and optimization of a differentiation medium to form cilia. At the same time a new bioreactor was developed. In which the cells could be supplied with cell culture medium and also the respiration could be simulated. Specific markers of the trachea for goblet cells, ciliary epithelium cells as well as tight junctions were detectable. First nanotoxicological tests showed no toxicological trends. Present methods of investigation of toxicity are designed only for monolayer-cultures and are not applicable in the area of nanotoxicology. Carbon-based nanoparticles can interact with the proteins of these assays and generate wrongly positive or negative results. Hence, one aspect of this work was the establishment of new methods for testing nanotoxicity, so the genetic expression analysis could be examined in primary keratinocytes by global genexpression. Already with the investigation of one quarter of the transcriptomes differences in expression patterns of the treated samples and the reference could be detected. Different specific markers of the keratinocytes, which are important for the development of the horny layer and therefore for the barrier function of the skin, for example SPRR4 and KLK7, were down regulated in the samples treated with nanomaterials. The cells which were in contact with titanium dioxide showed compared to treated cells with carbon black or multiwalled carbon nanotubes, a restriction of cell proliferation and adhesion. For the cells treated with Carbon Nanotubes a gene expression profile could identified, which showed restrictions in the cell cycle and a deficit to crosslink collagen structures. With the Raman spectroscopy which was used for the investigation of nanotoxicity, different reactions of the cells have already appeared after treatment with different nanomaterials. This method should be used for a quick screening in the nanotoxicology. Special fingerprints developed with the Raman spectroscopy could afford the classification of treated cells. This method should be better established in the nanotoxicology in the future. The genetic expression analysis and the Raman spectroscopy have been confirmed as new established methods and should be further developed as innovative tools for the nanotoxicology. Because the healthy skin shows a good barrier function, also other 3-D tissue models, which are similar to the organs of the human body, should be used in nanotoxicology for the determined analysis of body barrier structures