TRAIL susceptibility of human melanoma cells : relevance of the tumor progression stage

Die Tatsache, dass sich viele maligne Melanome resistent gegenüber dem tumorselektiven Liganden TRAIL (tumor necrosis-related apoptosis-inducing ligand) verhalten, erfordert erweiterte Ansätze in der Melanomtherapie. Durch die Untersuchungen, die mit 18 unterschiedlichen Melanomzelllinien durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass die TRAIL-Suszeptibilität unabhängig vom jeweiligen Tumorprogressionsstadium ist, und dass die Kostimulation mit einer sublethalen UVB-Dosis ubiquitär eine stark synergistisch sensibilisierende Auswirkung auf die TRAIL-resistenten Melanomzellen hat. Es zeigte sich hierbei, dass das TRAIL-Rezeptorexpressionsmuster (Agonisten versus Antagonisten) nicht ausschlaggebend für das Apoptoseverhalten der Melanomzellen ist. Vielmehr scheinen intrazelluläre Mechanismen für die unterschiedliche Suszeptibilität gegenüber TRAIL verantwortlich zu sein. Intrazelluläre Studien zeigten schließlich, dass die grundsätzliche TRAIL-Sensitivität durch Caspase-8-Spaltung und -Aktivität determiniert wird. Die UVB-induzierte Sensitivierung resistenter Zellen hingegen wird auf dem Niveau von Caspase-3 und XIAP entschieden. So geht die UVB-induzierte Sensitivierung mit einer verstärkten XIAP-Depletion und vollständiger Caspase-3-Prozessierung vom 21 kD Fragment in das katalytisch aktive 17 kD Fragment sowie dessen Aktivierung einher. Parallel zur XIAP-Depletion zeigte sich eine ebenfalls deutlich zunehmende Degradierung des NFkB-Inhibitors IkBa. Da NFkB ein Transkriptionsfaktor ist, der durch die Aufregulierung anti-apoptotischer Gene wie XIAP Apoptoseresistenz vermittelt, könnte so der TRAIL-induzierten Apoptose entgegengewirkt werden. Andererseits ist bekannt, dass NFkB in Anwesenheit von DNA-schädigenden Agenzien seine Eigenschaften an selektiven Promotoren ändert und so von einem Aktivator in einen Repressor dieser Gene konvertiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass eine NFkB-Freisetzung nach TRAIL und UVB-Kostimulation zu einer transkriptionellen Repression u.a. des XIAP-Gens führt und damit maßgeblich zu dessen zytosolischer Depletion und der Sensitivierung gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose beiträgt. Die Schlüsselrolle von XIAP in der Suszeptibilität von Melanomzellen gegenüber TRAIL konnte durch Überexpressions- und „knock down„- Versuche von XIAP eindeutig bestätigt werden. Durch Überexpression einer IkBa Superrepressorvariante konnte schließlich die Abhängigkeit der XIAP-Depletion und der Apoptose-Sensitivität von NFkB bestätigt werden. XIAP scheint also die entscheidende Rolle bei der Vermittlung der TRAIL-Resistenz in allen hier untersuchten Melanomzelllinien zu spielen. Die Entschlüsselung dieses ubiquitären, molekularen Sensitivierungsmechanismus durch Kombinationstherapie mit UVB zeigt neue Möglichkeiten wie die TRAIL-Resistenz im Melanomsystem durchbrochen werden kann und bietet somit die Basis für neue Therapieansätze zur erfolgreichen Bekämpfung des malignen Melanoms.The fact that a lot of malignant melanoma are resistant against the tumor-selective death ligand TRAIL (tumor necrosis-related apoptosis-inducing ligand) required an extension of approaches in the development of successful melanoma therapies. By analysing 18 melanoma cell lines it could be shown that TRAIL susceptibility is completely independent of the tumor progression stage, and that co-exposure to a sublethal ultraviolet B (UVB) light dose ubiquitously induces astrong synergistic, sensitization to TRAIL of initially resistant melanoma cells. In this context the TRAIL receptor expression pattern (agonist versus antagonist) proved to be not crucial regarding the apoptotic behaviour of melanoma cells. In fact intracellular mechanisms appeared to be rather responsible for the different TRAIL susceptibility. Finally intracellular studies pointed out that the basic TRAIL sensitivity is determined by caspase-8 cleavage and activity. However, the UVB-induced sensitization of TRAIL resistant cell lines is determined at the level of caspase-3 and XIAP. The UVB induced sensitization coincides with enhanced XIAP depletion and complete caspase-3 processing from the p21 fragment into the catalytically active p17 fragment as well as its activation. In parallel to the XIAP depletion a significantly increasing degradation of the NFkB-inhibitors IkBa also occurred. Due to the fact that NFkB is a transcription factor which mediates apoptosis resistance by upregulation of antiapoptotic genes like XIAP, it may therefore counteract TRAIL induced apoptosis. On the other hand it is known that NFkB changes its characteristics at selective promoters in presence of DNA damaging agents and so converts from an activator into a repressor of these genes. The present thesis confirms that NFkB release after TRAIL und UVB costimulation leads to transcriptional repression of the XIAP gen and so significantly contributes to its cytosolic depletion and sensitization against TRAIL induced apoptosis. The major role of XIAP in determining TRAIL susceptibility of melanoma cell lines could be univocally confirmed by XIAP overexpression and "knock down" experiments. Finally the dependence of XIAP depletion and apoptosis sensitization via NFkB could be confirmed by overexpression of a IkBa superrepressor variant. XIAP plays a crucial role in the mediation of TRAIL resistance in all melanoma cell lines which have been analysed in this study. The decoding of this ubiquitous molecular mechanism of sensitization by UVB in combination therapy offers new possibilities how TRAIL resistance in the melanoma system can be overcome and provides the basis for new therapeutic approaches for a successful combat of malignant melanoma