Protein engineering of P450 monooxygenases for the selective hydroxylation of cyclic and acyclic alkanes

Eine Aufgabe dieser Dissertation bestand darin, Enzyme zu finden und zu optimieren, die das lineare Alkan n-Octan selektiv, vorzugsweise in subterminaler(n) Position(en), hydroxylieren. Das enantiomeren-reine Endprodukt 2-Octanol wird häufig als Grundstoff in der Industrie zur Herstellung von Estern, pharmazeutischen und kosmetischen Artikeln, sowie für Lebensmittelzusätze verwendet. Als Katalysator für diese Reaktion wurden Cytochrom P450-Monooxygenasen (CYPs) ausgewählt, die die Fähigkeit besitzen molekularen Sauerstoff auf ein Substratmolekül, unter der Aufnahme von zwei Elektronen, zu übertragen. Eine weitere Thematik dieser Dissertation behandelte die enzymatische Hydroxylierung der im Erdöl vorkommenden Cycloalkane C8, C10 und C12. Die dafür verwendeten P450-Monooxygenasen sind prokaryotischen (Bacillus megaterium) und eukaryotischen (Candida apicola) Ursprungs. Im Dritten und somit letzten Kapitel der vorgelegten Dissertation wurde die Stabilisierung einer P450-Monooxygenase Häm-Domäne durch Immobilisierung auf unterschiedlichen mesoporösen Silikaten untersucht. Das P450-Enzym CYP102A1 aus B. megaterium, kurz auch P450 BM-3 genannt, wurde untersucht. Dank jahrelanger Forschung ist die P450 BM-3 sehr gut untersucht und die Sequenz- und Kristallstruktur-Informationen bekannt. Viele Mutationen, und deren Bezug zur Änderung der Substratspezifität sind aus der Literatur bekannt und geben Anhaltspunkte beim Protein Engineering. Mutationen an den Aminosäuren-Positionen F87, I263 und A328 des P450 BM-3-Enzyms resultierten in der gewünschten selektiven Hydroxylierung des n-Octans an subterminaler (ω-1) Position mit bis zu 92 % 2-Octanol-Produkt. Aufgrund der Chiralität an subterminaler Position wurde ebenfalls die Bildung von Enantiomeren betrachtet. Die Dreifachmutante F87V I263R A328F produzierte (R)-2-Octanol mit 60 % ee, die I263G-Mutante bildet hauptsächlich (S)-2-Octanol mit 80 % ee. Eukaryotische P450-Enzyme aus Candida-Stämmen besitzen gleichermaßen die Fähigkeiten der (sub-)terminalen Hydroxylierung, weshalb ebenso diese Systeme untersucht wurden. Die Membran-assoziierten CYP52E1 und CYP52E2 aus C. apicola wurden zum ersten Mal in E. coli in funktioneller Form exprimiert. Beide P450-Monooxygenasen benötigen für die Aktivität eine NADPH-Cytochrom P450-Reduktase (CPR). Mittels der „Genom-Walking“-Strategie, ist es gelungen, ein CPR-Gen zu identifizieren, zu klonieren und in E. coli zu exprimieren. Eine weitere Aufgabe im Rahmen dieser Arbeit war die inerten und sperrigen Cycloalkanen (C8, C10, C12) zu hydroxylieren. Bisher sind nur zwei Enzyme mit der Fähigkeit Cyclohexan (C6) umzusetzen bekannt: P450balk aus Alcanivorax borkumensis und eine Mutante der P450 BM-3. Dafür wurde in einer Zusammenarbeit mit der Bioinformatik-Gruppe am ITB eine „minimale“ Mutantenbibliothek erstellt, fokussiert auf drei Aminosäure-Positionen (F87, I263, A328), an denen ein Austausch mit fünf verschiedenen Aminosäuren durchgeführt wurde. Während der BM-3-Wildtyp die untersuchten Cycloalkane nur minimal (C8 = 8 %; C10 = 3 %) oder gar nicht (C12) umsetzt, brachten schon kleine Veränderungen in der Substratbindetasche eine starke Aktivitätssteigerung. Der Umsatz konnte durch Doppelmutationen auf 90 % (Cyclooctan), 70 % (Cyclodecan) und 46 % (Cyclododecan) gesteigert werden. Da Alkane in großer Konzentration P450-Enzyme beschädigen können, was letztendlich zu einer verringerten Produktivität führt, wurde ferne die Stabilisierung des Enzyms durch Immobilisierung auf verschiedenen mesoporösen Silikaten untersucht. Als Enzym wurde auch hier die P450 BM-3 verwendet, jedoch diesmal nur die 80 x 70 x 60 Å große Häm-Domäne (BM3H). Die verwendeten Silikate unterschiedlicher Porengröße (25-133 Å) und Wanddicke wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. Roger Gläser (Universität Leipzig) und Herrn Prof. Dr. Michael Hunger (Universität Stuttgart) synthetisiert und charakterisiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Größe der Pore mindestens die Größe des Enzymdurchmessers besitzen muss, um eine Bindung des Enzyms in den Poren zu ermöglichen. Die Enzymkonzentration, sowie Immobilisierungsvolumen spielen ebenfalls eine Rolle bei der Immobilisierung, sowie der Art der Durchmischung und pH-Wert der Enzymlösung.Selective oxidation of non-activated carbon atoms still remains an unsolved issue in synthetic chemistry. The major object of this thesis was to detect and optimize enzymes, which selectively hydroxylate the linear alkane n-octane, preferably in the subterminal position(s). The important chiral intermediates such as (R)- or (S)-2-octanol are widely used as a raw material in industry for the production of esters, pharmaceutical, cosmetics, and food additives. Since cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) have the ability to introduce molecular oxygen intro vast variety of organic molecules, they were applied as biocatalysts. Another theme of this thesis dealt with the enzymatic hydroxylation of the oil occurring cycloalkanes C8, C10 and C12. The incorporated P450 systems have their origin in prokaryotic (B. megaterium) and eukaryotic (C. apicola) organisms. In the final chapter of the dissertation the immobilization of a P450 monooxygenase heme domain on different mesoporous silicates was investigated. Within this work the best characterized and widely applied P450 enzyme CYP102A1 from B. megaterium, also known as P450 BM-3, and its mutants were investigated for oxidation of cyclic and acyclic alkanes in detail. Wild type P450 BM-3 is able to hydroxylated n-octane with very low activity, but produces a mixture of secondary alcohols. Replacements at positions 87, 263 and 328 of P450 BM-3 led to the mutants with desired selectivity towards ω-1 position. The best mutant (F87V A328F) produces up to 92 % 2-octanol product. Further the formation of enantiomers was considered as well. The triple mutant F87V I263R A328F produced (R)-2-octanol with 60 % ee, the I263G mutant is mainly (S)-2-octanol with 80 % ee. It is known from literature, that eukaryotic P450 enzymes from some Candida strains are also able to hydroxylate fatty acids at ω-1 position. Therefore two P450s CYP52E1 and CYP52E2 from C. apicola were investigated as well. For the first time these membrane-associated P450s were cloned and expressed in functional form in E. coli. Both P450 monooxygenases require for the activation of molecular oxygen electrons from a NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR). By means of the “genome walking”, it was possible to identify a CPR gene, to clone and express it in E. coli. Although the CPR was expressed in functional form and demonstrate reducing activity towards cytochrome c, no interaction of the recombinant CYP52E1 and CYP52E2 enzymes with the reductase could be observed. The further task of this study was to hydroxylate the inert and bulky cycloalkanes (C8, C10, C12). So far, only two enzymes with the ability to convert cyclohexane (C6) are known: P450balk from Alcanivorax borkumensis and a mutant of P450 BM-3. A minimal enriched P450 BM-3 mutant library was previously constructed by combining five hydrophobic amino acids (alanine, valine, phenylalanine, leucine and isoleucine) in two positions, 87 and 328, located directly above the heme group. For the BM-3 wild type of the cycloalkanes only a minimal (C8 = 8 %, C10 = 3 %) or no (C12) conversion could be observe, but even small changes in the substrate binding pocket resulted in a strong increase in activity. Double mutations led to 90 % cyclooctane, 70% cyclodecane and 46 % cyclododecane conversion. Since alkanes in high concentrations may damage P450 enzymes, and therefore lead to reduced productivity, the immobilization of the isolated heme domain of P450 BM-3 F87A (BM3H_F87A) on two mesoporous silicates, MCM-41 (pore diameter 25 Å) and SBA-15 (pore diameter 60 Å and 133 Å) was examined. The silicates of different pore sizes and wall thickness were synthesized and characterized by X-ray diffraction and nitrogen adsorption analyses before and after immobilization by Prof. Dr. Roger Glaeser (University of Leipzig) and Prof. Dr. Michael Hunger (Universitaet Stuttgart). The results revealed that the immobilization efficiency on MCM-41 and SBA-15 after single immersion was influenced by the pH value of the enzyme solution, initial enzyme concentration and agitation conditions. By modelling the 3D structure in silico and performing electrostatic potential calculations, which were carried out in the bioinformatics group of the ITB, the pH-dependence of the enzyme immobilization could be explained and a possible orientation of the protein on mesoporous materials could be predicted