Estudo da produção de Polihidroxibutirato por Herbaspirillum seropedicae SmR1 e seu mutante ntrC em diferentes fontes de carbono e relações carbono/nitrogênio

Orientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos SantosDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/08/2014Inclui referênciasResumo: Estudos com a finalidade de produzir bioplásticos, como polihidróxialcanoatos (PHA), têm crescido nas últimas décadas por ser uma alternativa sustentável para a produção de plásticos biodegradáveis e, portanto, uma alternativa ambientalmente viável para a substituição dos processos petroquímicos utilizados massivamente nos dias de hoje. Herbaspirillum seropedicae tem um grande potencial biotecnológico quanto à produção de PHA, sendo que essa capacidade já foi reportada sobdiferentes condições de cultivo. O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a produção de PHB na estirpe parental H. seropedicae SmR1 e no seu mutante ntrC, defectivo na expressão de NtrC, um importante regulador do metabolismo de nitrogênio em diversas bactérias. A estratégia desenhada nos permitiu avaliar a produção em alta e baixa relação carbono/nitrogênio (C/N) utilizando NH4Cl como fonte de nitrogênio e monossacarídeos ou ácidos carboxílicos como fontes de carbono. Entre os ácidos carboxílicos avaliados, o citrato se mostrou o mais promissor, já que a produção de polihidroxibutirato atingida foi de 47,1% de PHB/psc para H. seropedicae SmR1 e 76% de PHB/psc para o mutante ntrC. Entre os monossacarídeos testados, a D-frutose se destacou como a melhor fonte de carbono deste grupo, atingindo produções de 30,5% e 65,8% de PHB para SmR1 e o mutante ntrC, respectivamente. Interessantemente, a fonte de carbono em que H. seropedicae teve o melhor desempenho quanto a produção de PHB foi o glicerol. As produções de PHB atingidas foram de 74,4% e 78% para H. seropedicae SmR1 e mutante ntrC, respectivamente. De modo geral, observou-se que independente da fonte de carbono utilizada, as maiores produções de PHB foram obtidas quando as concentrações de amônio no meio eram menores que 5mM/L, o que indica que altas relações C/N favorecem a síntese de PHB em H. seropedicae. O mutante ntrC demonstrou em todas as condições avaliadas produzir entre 20 a 100% mais PHB do que a estirpe parental SmR1. A complementação do mutante ntrC com uma cópia integra do gene ntrC de H. seropedicae SmR1 reverteu sua maior produção de PHB, retornando aos níveis da estirpe SmR1. Este resultado indica que a proteína NtrC está regulando o processo de síntese de PHB em H. seropedicae. As principais conclusões deste trabalho são: (i) a produção de PHB depende da natureza da fonte de carbono e provavelmente da sua via de metabolização e da produção de metabólitos como acetil-CoA e equivalentes reduzidos(NADPH e NADH); (ii), o mutante ntrC em todas as condições testadas apresentou maior produção de PHB, indicando que a ausência de NtrC pode afetar o balanço metabólico em H. seropedicae favorecendo a produção de PHA. Palavras chaves: Herbaspirillum seropedicae, Pohidroxibutirato (PHB), razão carbono/nitrogênio, sistema NTR, ntrC.Abstract: Studies aiming to produce bioplastics such as polyhydroxyalkanoates (PHA) has grown in recent decades to be a sustainable alternative for production of biodegradable plastics is therefore an environmentally feasible alternative to the substitution of petrochemical processes use in massively days today. Herbaspirillum seropedicae has great biotechnological potential for the production of PHA, and this ability has been reported under different culture conditions. The main objective of this study was to evaluate the production of PHB in the parental strain H. seropedicae SmR1 and its ntrC mutant, defective in the expression of NtrC, an important regulator of nitrogen metabolism in various bacteria. The strategy allowed us to evaluate the production in high and low carbon/nitrogen (C/N) using NH4Cl as a nitrogen source and monosaccharides or carboxylic acids as carbon sources compared. Among the tested monosaccharides, D-fructose emerged as the best source of carbon this group, reaching yields of 30.5% and 65.8% PHB for SMR1 and ntrC, respectively. Interestingly, the carbon source that seropedicae H. had the best performance as PHB production was glycerol. The PHB production was achieved of 74.4% and 78% for H. seropedicae SMR1 and mutant ntrC, respectively. In general, it was observed that independent of the carbon source used, the highest production of PHB were obtained when the concentration of ammonia in the medium were lower than 5mM / L, indicating that high C/N ratios favoring the synthesis of PHB H. seropedicae. The ntrC mutant demonstrated in all conditions evaluated to produce between 20 and 100% higher than PHB SMR1 parental strain. The complementation of mutant ntrC integrates with a copy of the ntrC gene of H. seropedicae SmR1 reversed its largest production of PHB, returning to levels of strain SmR1. The complementation of mutant ntrC integrates with the copy of the ntrC gene of H. seropedicae SmR1 reversed its largest production of PHB, returning to levels of strain SmR1. This result indicates that indeed the NtrC protein is regulating the process of synthesis of PHB in H. seropedicae. The main conclusions are: (i) the production of PHB depends on the nature of the carbon source and probably its route of metabolism and the production of metabolites such as acetyl-CoA and reduced equivalnetes (NADPH and NADH); (ii) the ntrC mutant under all conditions tested showed higher production of PHB, indicating that the absence of NtrC can affect the metabolic balance in H. seropedicae favoring the production of PHA. Key words: Herbaspirillum seropedicae, Pohidroxibutirato (PHB), carbon/nitrogen ratio, NTR system, ntrC. XII