Identificação molecular de leveduras vínicas e implantação de um banco de dados suplementar fudamentado em espectrometria de massa maldi-tof

Orientadora : Profª. Drª. Tania Maria Bordin BonfimCo-orientador : Dr. Gildo Almeida da SilvaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 05/12/2014Inclui bibliografiaÁrea de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: A criação de Coleções de Culturas para preservação dos recursos genéticos ganhou grande importância nas discussões realizadas durante a Eco-92 para o estabelecimento da Convenção sobre Diversidade Biológica. As Coleções de Culturas têm a função de isolar, caracterizar, identificar, conservar e disponibilizar microrganismos para o desenvolvimento de processos e obtenção de produtos de interesse econômico. A Embrapa reconhece a importância da conservação dos recursos microbianos para o desenvolvimento científico e tecnológico do país. Hoje, uma das Coleções desta instituição consiste na Coleção de Leveduras da Embrapa Uva e Vinho. Esta Coleção, até pouco tempo atrás, era um banco de manutenção de leveduras para elaboração de vinho, no qual a identidade de poucas era conhecida. A transição para se tornar uma Coleção oficial envolveu a etapa de identificação de todas as leveduras criopreservadas, tendo sido este o objetivo deste trabalho. As identificações microbianas podem ser conduzidas por técnicas convencionais (testes bioquímicos e morfológicos), técnicas de biologia molecular ou por método analítico como a espectrometria de massa. Este último apresenta alto rendimento, o que constitui uma vantagem para grandes demandas de identificações. Assim, as 871 linhagens de leveduras vínicas autóctones analisadas foram identificadas por espectrometria de massa com analisador de tempo de voo e ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Esta técnica exigiu a construção de uma biblioteca suplementar tendo em vista que os bancos de dados comerciais possuem, na sua maioria, espectros de referência voltados a microrganismos de importância clínica. Previamente a inserção das espécies no banco de dados suplementar, as espécies foram identificadas por técnicas de biologia molecular renomadas como PCR-RFLP e sequenciamento genético. Para a primeira foi amplificado a região ITS do DNA ribossomal com subsequente restrição enzimática usando as endonucleases CfoI, HaeIII, HinfI, DdeI e MboII. Para a segunda técnica utilizou-se o sequenciamento da região D1/D2 do 26S rDNA. O banco de dados comercial usado foi capaz de identificar apenas 65,2% das leveduras analisadas. Ao empregar o Banco de Dados Suplementar todas as linhagens remanescentes foram também corretamente identificadas. Este banco de dados já tem sido utilizado por outros grupos de pesquisa associados a leveduras ambientais, demostrando a aplicabilidade e a extensão da utilidade do mesmo. MALDI-TOF/ MS demonstrou ser uma técnica rápida, precisa e de baixo custo analítico para identificação taxonômica de leveduras ambientais com caráter industrial. Palavras-chave: MALDI-TOF/EM; PCR-RFLP; ITS; Sequenciamento; TaxonomiaAbstract: The creation of Culture Collections to preserve the genetic resources conquered great importance in the discussions carried out during Eco-92 in order to establish the Convention on Biological Diversity. The Culture Collections are intended to isolate, characterize, identify, conserve and distribute microorganisms. Embrapa recognizes the importance of maintaining microbial resources to give support to scientific and technical development of the country. Nowadays, one of Embrapa's Collections consists of Yeast Collection belonging to its subunit Embrapa Grape and Wine. This Collection, short while ago, was considered a local of yeast maintenancebiased to vinification process, in which the identity of just a few was known. The transition to turn into an official Collection comprised an identification step of all cryopreserved yeasts, which became the principal aim of the present study. Microbial identification can be carried out by conventional techniques (biochemical and morphological tests), molecular biology techniques or by analytical methods such as mass spectrometry. The latter has a high yield, which consists in an advantage to large demands on identifications. Thus, 871 autochthonous wine yeast strains were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. This technique demanded the construction of a supplementary database, once the commercial databases available retain its standard spectrum biased towards microorganisms of clinical importance. Previously the step of spectrum insertion in the supplementary database, the species were identified by renowned molecular biology techniques as PCR-RFLP and sequencing. The first method amplified ITS region of ribosomal DNA with subsequently enzymatic restriction employing endonucleases CfoI, HaeIII, HinfI, DdeI e MboII. For sequencing, 26S rDNA D1/D2 region were amplified. The commercial database used were able to identify only 65.2% of the analysed yeast, while using also the Supplementary Database all the remaining strains were correctly identified. This Database has already been used by other research groups associated with environmental yeasts, demonstrating its applicability and usefulness. MALDI-TOF MS has demonstrated to be a fast, precise and a low analytical cost technique for taxonomic identification of environmental yeast strains with an industrial character. Keywords: MALDI-TOF/MS; PCR-RFLP; ITS; Sequencing; Taxonom