Via indolamina 2,3-dioxigenase/quinurenina como pontencial alvo farmacológico no tratamento da dor neuropática associada ao diabetes

Orientador : Profª. Drª. Joice Maria da CunhaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 05/08/2016Inclui referências : f. 78-100Resumo: O diabetes é uma doença crônica, debilitante e de alta prevalência, cuja gravidade aumenta com o aparecimento de complicações subjacentes. Dentre estas, a dor neuropática diabética (DND) parece estar associada à morbidade e mortalidade no diabetes, dada a dificuldade de tratamento. A fisiopatologia da DND tem sido associada à redução do tônus imposto pelo sistema descendente inibitório, incluindo aqueles dependentes da liberação de serotonina (5-HT). Neste contexto, nossa hipótese é de a via indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1)/quinureninas (KYN) possa estar envolvida no mecanismo patológico da DND, uma vez que a mesma é a principal via de catabolismo do triptofano, levando à depleção de serotonina e à produção de quinureninas neurotóxicas. Assim, nosso objetivo foi investigar o papel da via IDO1/KYN na alodinia mecânica em animais com diabetes experimental induzido quimicamente por estreptozotocina (STZ). Verificamos que a alodinia mecânica inicia-se 2 semanas após a indução do diabetes, com pico na 4ª semana, havendo redução de cerca de 20% no limiar mecânico dos animais diabéticos (Dbt) quando comparados aos animais normoglicêmicos (Ngl). Corroborando a nossa hipótese, foi observado que 1) animais Dbt apresentam significativa redução os níveis de 5-HT no cordão espinhal (CE), com baixa reposição deste neurotransmissor (evidenciada pelo aumento da razão 5-HT1AA/5-HT) nesta estrutura e 2) o tratameto com fluoxetina (bloqueador da recaptação da serotonina) induziu efeito antinociceptivo nestes animais. Apesar da expressão de IDO1, enzima passo-limitante da via, não estar alterada em CE de animais Dbt quando comparada aos animais Ngl, o tratamento com 1-L-metil triptofano (antagonista da IDO1) promoveu antinocicepção em animais Dbt. A ausência de alteração na expressão da IDO no CE de animais Dbt pode estar associada a não observação de alterações significativas nos níveis de citocinas inflamatórias (IL-1ß, IL-6 e TNFa) nem nos marcadores para astrócitos (GFAP) e micróglia (IBA-1) no CE destes animais. Curiosamente, os níveis de IL-1ß e TNFa em nervo ciático de animais Dbt apresentam-se reduzidos quando comparados aos níveis observados em animais Ngl. Da mesma forma, a enzima quinurenina 3 monoxigenase (KMO), também importante na geração de KYN, não se demonstrou aumentada em animais Dbt em relação ao grupo Ngl, embora seu bloqueio farmacologíco pelo tratamento com JM-6 tenha induzido significativo efeito antinociceptivo nestes animais. Por fim, dada a ativação de receptores NMDA por algumas KYN, verificamos que a administração intratecal de um antagonista NMDA o MK-801 também aumentou significativamente o limiar mecânico em animais Dbt. Assim, podemos concluir que a ativação da via IDO1/KYN parece estar associada ao desenvolvimento da DNP, levando tanto a redução de 5-HT e, portanto, da ativação das vias descendentes inibitórias quanto ao aumento da produção de KYN, as quais possivelmente devido à ligação aos receptores NMDA aumentam o tônus das vias descendentes facilitatórias.Abstract: Diabetes is a highly disabling chronic disease, prevalent in both low and high income countries. Among the complications, the diabetic neuropathic pain (DNP) is cited as one of the main and more difficult to treat complication and is highly linked to higher mortality and morbidity in diabetic patients. The pathophysiology of DNP has been associated with a reduction of endogenous inhibitory descending pathway tonus, including the fat ones driven by neurotransmitters as serotonin. In this context, our hypothesis is that the indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1)/kynurenine (KYN) pathway might be related to the pathological process of DNP, since this pathway is mainly related to the L-tryptophan catabolism, lowering serotonin levels and also producing neuroactive kynurenines. Then, we investigated the role of IDO1/KYN in the generation of mechanical allodynia in streptozotocin (STZ)-diabetic animals (Dbt) in which the mechanical allodynia was initiated 2 weeks after the STZ injection, peaking in the fourth week. Corroborating our hypothesis, we observed that Dbt rats have reduced spinal cord serotonin levels, and lower 5-HT turnover evidenced by an increase of the 5-HIAA/5HT ratio and that the mechanical allodynia in Dbt rats is significantly prevented by SSRI fluoxetine. Although the rate limiting enzyme IDO1 expression was not altered in the spinal cord from Dbt rats, the pharmacological blockade of IDO1 by 1-L-MT evoked a significant reduction in the mechanical allodynia in these animals. Pro inflammatory cytokine levels (IL-1ß, IL-6 e TNFa) in the spinal cord did not differ between normoglycemic (Ngl) and Dbt rats while in sciatic nerve, we observed a reduction of IL-1ß and TNF-a levels, revealing a lower pro inflammatory tonus in these tissues, which might explain the absence of statistical difference of IDO1 expression in the spinal cord. Given the presence of IDO1/KYN in glial cells and its importance for the neuropathic pain states, we observed no effect of diabetes on the expression of IBA-1 (microglial marker) and GFAP (astrocytic marker) production between Ngl and Dbt animals. In addition, immunofluorescence revealed morphological changes in astrocytic cells in the spinal cord of Dbt animals 3 and 4 weeks after the STZ injection, prompting to idea that these cells might have an alteration in its metabolism or function. The kynurenine 3-monooxigenase (KMO) enzyme, another important enzyme for the kynurenine generation, remained unchanged in Dbt rats after 4 weeks when compared to Ngl group, despite its blockade induced antinociception by JM-6 in these animals. Since NMDA receptors might be activated by quinurenins, as these receptors are upregulated in the DPN, we further demonstrated that the pharmacological blockade of these receptors also promoted reduction in the mechanical allodynia in Dbt group. All together, our data suggest that the physiopathology of DNP may involve the overactivation of IDO1/KYN pathway, which explained the decrease of serotonin levels/ turnover and the pharmacological effectiveness of compounds that interfere directly or indirectly in this pathway over the mechanical allodynia in DBT animals. Further studies however are needed to characterize the importance of this pathway activation not only in DNP but also in other neuropathic pain conditions