Polissacarídeos produzidos por basidiomicetos e ascomiceto : caracterização estrutural e atividade imunomoduladora

Orientador : Prof. Dr. Marcello IacominiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 27/03/2012Bibliografia: fls. 115-125Resumo: A presente pesquisa visou isolar e caracterizar polissacarídeos presentes em cogumelos comestíveis, bem como determinar novos métodos de obtenção dessas moléculas através de cultivo submerso desses fungos. O objetivo de se estudar esses polissacarídeos, em especial as p-glucanas, é devido à capacidade dos mesmos em atuar como imunomoduladores no organismo humano, propiciando a melhora para algumas doenças como tumores, artrite reumatóide, alergias, entre outras. Foram testados alguns polissacarídeos isolados em um modelo de estudo para a resposta imune, utilizando a linhagem monocítica de células humanas THP-1. Inicialmente foram determinadas algumas condições de cultivo do basidiomiceto Pleurotus pulmonarius, sendo possível obter polissacarídeos semelhantes aos isolados do basidioma, com rendimento superior. Também foram utilizados os cogumelos Agaricus bisporus, A. brasiliensis e Cordyceps militaris, com os quais se procederam a extrações aquosas e alcalinas, seguidas de processos de purificação para obtenção de seus polissacarídeos. Os dois primeiros também são basidiomicetos e apresentaram polissacarídeos semelhantes, considerando que pertencem ao mesmo gênero. Foi observada a presença de uma p-glucana-(1->6), de uma a-glucana- (1->4)-(1->6) e de uma manogalactana em ambos os cogumelos. Entretanto, as proporções de cada um variaram entre eles, sendo que A. bisporus apresentou maior teor do heteropolissacarídeo, enquanto A. brasiliensis apresentou maior teor de p-glucana. Extratos brutos de ambos os basidiomicetos foram testados em macrófagos, sendo seus efeitos semelhantes, independentemente da composição polissacarídica apresentar essa variação na proporção. Pôde-se observar moderado aumento na expressão de IL-ip, TNF-a e COX-2 e inibição dos efeitos inflamatórios de LPS quando as células foram tratadas com esses extratos. As p-glucanas-(1->6) de Agaricus spp. apresentaram elevado aumento da expressão dos genes pró-inflamatórios testados e moderada inibição dos efeitos de LPS. Também foram isolados uma galactomanana com alto teor de ramificação de C. militaris e uma p-glucana-(1->3) linear. Ambos os polissacarídeos são comumente encontrados em ascomicetos, grupo ao qual este cogumelo pertence. A p-glucana-(1->3) foi analisada quanto a sua capacidade de estimular o sistema imune, mostrando ser incapaz de estimular a expressão de IL-ip, TNF-a, COX-2 e NF-KB. Entretanto, essa mesma glucana apresentou grande inibição dos efeitos desencadeados por LPS, mostrando uma capacidade antiinflamatória. Sugere-se que as p-glucanas-(1->6), por serem solúveis, estejam ativando receptores do tipo Toll like (TLRs), os quais ativam a expressão de NF-KB, que por sua vez, estimula a produção de outras moléculas pró-inflamatórias. A p-glucana-(1->3) foi, entretanto, incapaz de ativar esses receptores. A insolubilidade em água dessa molécula sugere que a ligação ocorra com o receptor dectina-1, entretanto ainda precisa ser esclarecida qual via de ativação é desencadeada por essa ligação, visto que os efeitos gerados são antiinflamatórios. Moléculas solúveis também podem ligar-se a dectina-1, porém somente moléculas insolúveis são capazes de ativar esse receptor. Outros estudos são necessários para se determinar como essas p-glucanas estão inibindo a ação inflamatória do LPS, sendo uma possível explicação, a competição pela ligação com o mesmo receptor de membrana. Os resultados observados nessa pesquisa mostraram a importância da determinação da estrutura química dos polissacarídeos para uma eficiente avaliação das suas propriedades terapêuticas, visando esclarecer mecanismos de ação, vias de ativação, bem como os efeitos proporcionados pelo tratamento com essas moléculas.Abstract: The present study aimed to isolate and characterize the polysaccharides from edible mushrooms, as well as to determine new approaches to obtain these molecules by using submerged culture of fungi. The objective of studying these polysaccharides, specially pglucans, is related to their immunomodulatory activities in the human body, providing an improvement in some diseases such as tumors, arthritis, allergies, and others. Some of the isolated polysaccharides were tested by using an immune response model of human acute monocytic leukemia cell line, THP-1. Initially, some conditions for the submerged culture of Pleurotus pulmonarius were determined, which provided similar polysaccharides comparing to the fruit body ones, although the yield was higher. Some other mushrooms, as Agaricus biporus, A. brasiliensis, and Cordyceps militaris, were also studied. They were submitted, separately, to aqueous and alkaline extractions, followed by purification procedures to obtain the isolated polysaccharides. The Agaricus spp. belong to basidiomycetes group and both presented similar polysaccharides, which is in accordance as they also belong to the same genera. It was observed the presence of a p-glucan-(1->6), an a-glucan-(1->4)-(1->6), and a mannogalactan in both mushrooms. Although the proportion of each polymer in each mushroom was different: the A. bisporus contained higher amounts of mannogalactan and A. brasiliensis presented higher level of p-glucan. Crude extracts of these mushrooms were tested in macrophages, and besides their polysaccharide proportions were different, their effects were similar. It was observed a moderate increase in the expression of IL-ip, TNF-a, and COX-2 while the cells were treated with the extracts, and they also inhibited the LPS inflammatory effect in these cells. The p-glucans-(1->6) of Agaricus spp. presented high increase of the expression of the pro-inflammatory genes and moderate inhibition of the LPS effects. A highly branched galactomannan and a linear p-glucan (1->3)-linked were isolated from C. militaris. Both polysaccharides are commonly found in ascomycetes, in which C. militaris is also included. The p-glucan-(1->3) was analyzed to verify its capacity of immune stimulation and it failed in stimulating the expression of IL-ip, TNF-a, COX-2, and NF-KB. Nevertheless, this same glucan presented strong inhibition of the LPS inflammatory effects, showing an anti-inflammatory activity. It is possible that the p-glucans-(1->6), which are very soluble, can activate Toll like receptors (TLRs), that activate the NF-KB expression, and subsequently augment other pro-inflammatory molecules. Although, the p-glucan-(1->3) was unable of activating these receptors. The insolubility in water of this molecule suggests that it can bind dectin-1 receptor, although it still remains unclear which is the activation role initiated by this complex, considering that the observed effects were anti-inflammatory. Soluble molecules can also bind dectin-1 receptor, however only insoluble molecules can activate it. More studies are necessary to determine how the p-glucans are inhibiting the inflammatory effects of LPS, considering as a possible explanation, the competition for the same receptor linkage site. The observed results of this research showed the importance of determining the chemical structure of polysaccharides to evaluate efficiently their therapeutic properties, aiming to clarify the action mechanisms, the activation roles, as well as the effects promoted by the treatment with these molecules