Estudo de mutações do gene CFTR e da concentração sérica da lectina ligante de manose (MBL) em crianças com fibrose cística identificadas pela triagem neonatal

Orientador: Prof. Dr. Nelson Augusto Rosário FilhoCo-orientadora: Profª. Drª. Lilian Pereira FerrariTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 19/12/2014Inclui referênciasResumo: A fibrose cística é uma doença hereditária autossômica recessiva, causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Apresenta grande variação clínica, mesmo entre pacientes com o mesmo genótipo, sugerindo que outros fatores genéticos e/ou ambientais possam estar influenciando em seu curso, principalmente em relação à doença pulmonar. Um destes fatores é a lectina ligante de manose (MBL), proteína com importante papel na primeira linha de defesa do sistema imune inato, cuja deficiência aumenta a suscetibilidade para diferentes doenças infecciosas, principalmente a patógenos extracelulares. O estudo teve como objetivo analisar a frequência de mutações do gene CFTR e das concentrações séricas de MBL em crianças com fibrose cística identificadas pela triagem neonatal. Foram avaliadas 51 crianças com diagnóstico confirmado de fibrose cística, de ambos os gêneros, euro descendentes, identificadas pela triagem neonatal e acompanhadas no período de fevereiro de 2010 a janeiro de 2011. Foi coletada amostra sanguínea para extração de DNA e análise da concentração sérica de MBL. O DNA foi submetido à amplificação por PCR, e avaliado por eletroforese em gel de poliacrilamida(12%) ou agarose (2%) de acordo com o tamanho do fragmento. A concentração sérica de MBL foi determinada por meio de imunoensaio enzimático. Dos 102 alelos estudados, 84 (82,4%) correspondiam as mutações estudadas, sendo as maiores frequências observadas para p.Phe508del (38,2%) e p.Gly542X (26,5%). As mutações p.Asn1303lys, p.Lys684serfsX38 e p.Arg1162X foram detectadas em 9 (8,8%), 5 (4,9%) e 4 (3,9%) alelos respectivamente. Houve predomínio do genótipo p.GlyG542X/outra mutação (29,4%), seguido dos genótipos p. Phe508del/p. Phe508del (21,6%) e Phe508del/outra (17,7%). Destaca-se ainda o genótipo p.Phe508del/p.Gly542X (15,7%). Observou-se valores superiores para as mutações p.Gly542X e p.Asn1303lys em relação ao descrito na literatura (p0,05). Em relação a MBL não foram encontradas diferenças estatísticas entre o grupo de crianças com fibrose cística e controles, assim como não foram encontradas relações entre os níveis de MBL e infecções de vias aéreas superiores e inferiores, microbiota do escarro e os genótipos CFTR pesquisados. Este estudo caracteriza-se por ser inédito no estado do Paraná em se tratando de análise de mutações do gene CFTR em crianças fibrocísticas triadas ao nascimento, e sugere que pacientes portadores da mutação p.Gly542X vinham a óbito antes mesmo do diagnóstico clínico da doença subestimando a frequência real desta mutação e consequente subdiagnóstico.Abstract: Cystic fibrosis is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene. It has great clinical variation, even among patients with the same genotype, suggesting that other genetic and / or environmental factors may be influencing its course, primarily in relation to pulmonary disease. One of these factors is the mannose binding lectin (MBL) protein with an important role in the first line of defense of the innate immune system, whose deficiency increases susceptibility to various infectious diseases, primarily extracellular pathogens. The present study aimed to analyze the frequency of mutations in the CFTR gene and serum MBL concentrations in children with cystic fibrosis identified by newborn screening. Fifty one children with a confirmed diagnosis of cystic fibrosis, of both genders, euro descendants, identified by newborn screening and followed up from February 2010 to January 2011. We collected blood sample for DNA extraction and analysis of serum MBL. The DNA was subjected to PCR, and evaluated by electrophoresis in polyacrylamide gel (12%) or agarose (2%). The serum concentration of MBL was determined by using enzyme immunoassay. Of 102 alleles studied, 84 (82.4%) were detected, with the highest frequency observed for p.Phe508del (38.2%) and p.Gly542X (26.5%). The p.Asn1303lys, p.Lys684serfsx38 and p.Arg1162X mutations were detected in 9 (8.8%) 5 (4.9%) and 4 (3.9%) alleles respectively.There was a predominance of genotype p.GlyG542X / other mutation (29.4%), followed by genotypes p. Phe508del / w. Phe508del (21.6%) and Phe508del / other (17.7%). Another highlight is the genotype p.Phe508del / p.Gly542X (15.7%). We observed higher values for p.Gly542X and p.Asn1303lys mutations compared to that described in the literature (p 0,05) was found. Regarding MBL no statistical differences were found between the group of children with cystic fibrosis and controls, as well as no relationship between levels of MBL and infections of upper and lower airway microorganisms of sputum and CFTR genotypes studied were found. This study is unique in Paraná in the case of analysis of fibrocystic children screened at birth and suggests that patients with the mutation p.Gly542X died even before the clinical diagnosis of the disease providing under diagnosis and led to underestimation of the actual frequency of this mutation in Paraná