Sequenciamento do gene glnA das estirpes mutantes HM14, HM26, HM053 e HM210 de Azospirillum brasiliense

Orientadora: Roseli WassenMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : Azospirillum brasilense é uma proteobactéria gram-negativa, diazotrófica, microaerófila, capaz de viver livremente no solo ou em associação com raízes de diversas gramíneas de importância econômica, onde promove crescimento vegetal. A fixação biológica do nitrogênio pode ser catalisada naturalmente em bactérias diazotróficas por meio do complexo protéico da nitrogenase. O produto dessa reação, a amônia, junto com o glutamato, é utilizado como substrato pela glutamina sintetase (GS) para a formação da glutamina, a qual é utilizada pela planta e pela bactéria como substrato em outras reações de síntese de compostos nitrogenados. A GS é produto do gene glnA, o qual faz parte do operon glnBA em A. brasilense. Em 1988, Machado obteve mutantes excretores de amônio de A. brasilense, a partir da estirpe Sp7, denominadas estirpes: HM14, HM26, HM053 e HM210, capazes de fixar nitrogênio constitutivamente e excretar quantidades consideráveis de amônio. Este fenótipo pode ser resultante de mutações em diversos genes, mas provavelmente estão presentes no gene glnA. Todos os mutantes apresentam baixa capacidade de sintetizar glutamina, a qual é a provável razão pela qual o amônio excedente é excretado. No presente trabalho, o gene glnA das quatro estirpes foi sequenciado e deverá contribuir para a compreensão do fenótipo destas estirpes e para a identificação de aminoácidos importantes para a atividade biossintética de GS. HM14 apresenta baixos níveis de atividade transferásica total de GS e esta é parcialmente regulada por amônio, semelhante ao da estirpe selvagem. Nele foram observadas duas mutações, uma que troca o resíduo de histidina na posição 248 para arginina e outra do resíduo de leucina na posição 291 para arginina. Ambos estão localizados na superfície das subunidades que compõem a estrutura da enzima e podem estar levando a um comprometimento de sua estrutura e atividade biossintética. Na estirpe HM053, a qual também possui baixa atividade transferásica total de GS, mas mantida altamente adenililada, foi identificada uma mudança do resíduo de prolina na posição 347 para leucina. Esses resíduos estão próximos a arginina 339 e a arginina 359, as quais são importantes como sítios de ligação a ATP e glutamato. Na estirpe HM26 foi detectada uma troca de glicina por cisteína na posição 53. Este resíduo alterado está ao lado do aspartato 52, que é um aminoácido envolvido na conversão de amônio em amônia, essencial para a síntese de glutamina. Na estirpe HM210 foi detectada uma troca de glicina por serina na posição 129. A serina está ao lado de dois resíduos de glutamato que coordenam metais que estabilizam ATP e interagem com outro substrato da GS, o glutamato. As mutações encontradas em HM26, HM053 e HM210 provavelmente afetam o mecanismo catalítico e induzem a baixa atividade biossintética de GS