Análise do perfil de metilação dos genes MMP2 e MMP14 em linhagens tumorais de mama e em tumores primários de mama utilizando a técnica de MSP

Orientadora: Giseli KlassenCoorientadora: Edneia Amancio de Souza Ramos CavalieriMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e a principal causa de morte entre as mulheres. Alterações na regulação da expressão gênica por eventos epigenéticos são mecanismos comuns neste tipo de câncer. MMP14 e MMP2 são enzimas pertencentes ao grupo das metaloproteases, capazes de degradar o colágeno, um dos principais constituintes da matriz extracelular. Sua função é amplamente descrita por atuar no mecanismo de metástases em diversos tipos de câncer. Dados recentes demonstraram que a linhagem tumoral de mama MCF7 possui o gene MMP2 regulado por metilação do DNA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de metilação do promotor dos genes MMP14 e MMP2 em um painel de linhagens tumorais para posterior aplicação dos resultados em tumores primários de mama utilizando a técnica de MSP (methylation specific PCR). Para isso, amostras de DNA foram isoladas das linhagens tumorais MDA-MB-231, MDAMB-435, MCF7 e HB4a (linhagem controle normal) e tratadas com bissulfito de sódio. A ilha de CpG contendo 383 pares de bases do promotor do gene MMP2 das linhagens foi amplificada por PCR, purificada em gel de agarose 1%, ligada ao vetor pGEMT®easy e eletroporado em estirpe de E. coli DH10B. Oito clones recombinantes para cada linhagem foram selecionados por a-complementação, confirmados por PCR, purificados e submetidos à técnica de sequenciamento utilizando Big Dye Terminator v3.1. Não foi possível a amplificação concomitante das ilhas de CpG do gene MMP14, e novos iniciadores devem ser planejados. Os resultados mostraram que a linhagem normal HB4a, que expressa o gene MMP2, apresentou 18,1% de metilação global enquanto as linhagens tumorais que não expressam MMP2, MCF7 e MDA-MB-231, mostraram 87,7% e 86,2% de metilação global, respectivamente. O perfil de metilação das linhagens tumorais permitiu planejar a localização dos iniciadores para a técnica de MSP capazes de distinguir as amostras metiladas das não metiladas. Entretanto, a reações de PCR utilizando esses iniciadores não ocorreram como esperado. Por isso, em continuidade ao estudo foi realizada a clonagem e o sequenciamento da ilha de CpG do gene MMP2 a partir de amostras de tumores primários de mama sendo que uma das amostras com expressão positiva da proteína MMP2 apresentou-se altamente metilado (92,8%). Portanto, podemos concluir que a metilação do DNA pode não ser o único mecanismo epigenético de regulação do gene MMP2. Os resultados obtidos demonstram que o gene MMP2 não pode ser avaliado por MSP em amostras de tumores devido a sua heterogeneidade no perfil de metilação, não correspondente à expressão do gene. Resultados como esse ainda não foram descritos na literatura e farão parte de novos estudos para compreensão do envolvimento de MMP2 no câncer de mama