Diagnostische Fusions- und Linkerproteine zur Entwicklung neuartiger Immunoassays

In dieser Arbeit wurden Linker-/Fusionsproteine rekombinant hergestellt und getestet. Sie dienten der Entwicklung neuartiger Analyseverfahren, sowie der Verbesserung bereits bestehender antikörperbasierter Analyseverfahren. Hierbei wurde vor allem die Eigenschaft des Concanavalin A Proteins genutzt, um die Proteine auf Oberflächen zu immobilisieren, die vorher mit einer Zuckerverbindung beschichtet wurden. Das universale, bifunktionale Linkerprotein ConA-SAv sollte der Entwicklung eines Anreicherungsmoduls, für die Aufreinigung eines Analyten aus komplexen Matrizes dienen. Hierzu wurde das Gen der Concanavalin A Bindedomäne C-terminal, mittels Alanin Linker, an das Gen der Streptavidin Bindedomäne fusioniert, um die Anbindung biotinylierter Antikörper zu ermöglichen. Die Expression wurde in E. coli durchgeführt und die Funktionalität des Proteins mit mehreren Methoden untersucht. Das Ergebnis der Co-IP bewies die volle Funktionsfähigkeit des Linkerproteins ConA-SAv; beide funktionalen Domänen sind bindungsaktiv. Die Regenerierbarkeit von der Dextran-Matrix in Form von Sephadex® G-25 Beads konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der RIfS Messungen sind ebenfalls positiv zu werten. Das Linkerprotein allein konnte problemlos von einer mit Dextran funktionalisierten Chipoberfläche, durch einen konkurrierenden Zucker abgelöst werden. Allerdings war die Regeneration des Linkerproteins, bei Anbindung des biotinylierten Antikörpers, eingeschränkt. Zur weiteren Untersuchung wurden SPR Messungen durchgeführt. Diese bestätigten die Beobachtungen, die bereits an der RIfS gemacht wurden. Das Linkerprotein war bei Anbindung eines biotinylierten Antikörpers nicht mehr von der Oberfläche zu lösen. Im weiteren Verlauf wurden Fusionsproteine für die Borreliosediagnostik entwickelt. Hierzu wurden spezielle Oberflächen-Antigene ausgewählt, gegen welche das Immunsystem, insbesondere in der Frühphase der Infektion, während der IgM Antwort, Antikörper bildet. Nach Literaturrecherche stellten sich das Oberflächen Protein C (OspC) sowie ein Epitop (C6) des VlsE Antigens als gute Wahl heraus. Beide cDNA Sequenzen der Epitope wurden jeweils C-terminal, durch eine kurze Linkersequenz, an die cDNA Sequenz des ConA gekoppelt und anschließend in E. coli rekombinant hergestellt. Nach Expression wurden die Fusionsproteine mittels SPR und RIfS auf ihre Funktionalität untersucht. Die Ergebnisse der SPR Messungen zeigten die Funktionalität beider Fusionsproteine. Die Fusionsproteine banden auf die mit Mannan funktionalisierten Goldoberflächen und detektieren spezifisch die Antikörper aus den Testseren. Die Messungen mittels RIfS konnten diese Beobachtungen nur bestätigen. Allerdings erwies sich insbesondere das ConA-OspC Protein als wenig stabil. Daher wurde in Hinblick auf einen Einsatz in kommerziell erhältlichen Produkten die Lagerbeständigkeit, bei Lyophilisierung der beiden Proteine untersucht. Diese Untersuchungen wurden mittels ELISA-Messreihen durchgeführt. In den ELISA-Messungen zeigten beide Proteine eine sehr hohe Signifikanz in der Detektion der Borreliose-Antikörper aus dem Blutserum. Sie behielten auch nach der Lyophilisierung ihre Funktionsfähigkeit, allerdings bestätigten sich auch hier wieder die Ergebnisse aus den SPR Messungen. ConA-OspC war im Gegensatz zu ConA-C6 wesentlich instabiler und verlor stark an Signalstärke. Jedoch konnte durch die Anwendung spezieller stabilisierender Reagenzien die Signalstärke und die Lagerbeständigkeit verbessert werden. Zuletzt wurde ein zweites, universelles Linkerprotein entwickelt, welches es ermöglichte, eine Vielzahl unmarkierter IgG-Antikörper auf mit Zucker funktionalisierten Oberflächen zu binden. Hierzu wurde die cDNA einer Bindedomäne des Protein A C-terminal, durch eine kurze Linkersequenz, an die cDNA Sequenz des ConA gekoppelt und anschließend in E. coli rekombinant hergestellt. Die Funktionstestung erfolgte mittels SPR, zuerst unter Anwendung eines Modell-Assays, der anschließend erfolgreich auf eine Diagnostik im Veterinärbereich übertragen wurde. Die Detektion einer akuten Pankreatitis sowie einer Pankreas-Insuffizienz bei Katzen, erfolgte über die Messung des fTLI Spiegels im Blutserum. Mittels SPR gelang die Erstellung einer Kalibriergeraden aus Proben mit bekannter fTLI Konzentration, zur weiteren Ermittlung von unbekannten fTLI Konzentrationen in Realproben. Um eine Point-of-Care Diagnostik darzustellen, wurden 3D-Polymersinterkörper mit einer Zuckerverbindung funktionalisiert und die Analysenmethode wurde von der 2D- auf die 3D-Oberfläche übertragen. Auch hier gelang die Erstellung einer Kalibriergeraden anhand bekannter Probenkonzentration. Auf dieser Grundlage konnte erfolgreich eine weiterführende Konzentrationsbestimmung durchgeführt werden