Strahlenbiologische Charakterisierung des murinen Lewis-Lung-Modells

Hauptbestandteil der Arbeit war die strahlenbiologische Charakterisierung muriner LLC1-Zellen in vitro. Dabei handelt es sich um in Kultur überführte Einzelzellen eines bei in vivo Experimenten weit verbreiteten Tumormodells der Maus. Die soliden, entdifferenzierten Tumorzellverbände in vivo entsprachen einem nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom, auch die in Kultur überführten Einzelzellen konnten aufgrund von Kernpleomorphie, Hyperchromasie, atypischen Mitosen und verschobener Kern-Plasma-Relation als maligne eingestuft werden. In Kultur zeigten die LLC1-Zellen unter optimalen Bedingungen ein schnelles, stabiles Wachstumsverhalten- mit einer Verdopplungszeit von 16 h- auch über lange Kultivierungszeiträume hinweg, reagierten aber Wachstumsmedium, Aussaatdichte sowie Art und Beschichtung der Wachstumsfläche betreffend, ausgesprochen sensibel auf Veränderungen des Kultur-Milieus. Dabei prägten sie divergente Phänotypen aus, die sich vor allem hinsichtlich ihrer Morphologie, Adhäsionsfähigkeit und Plattierungseffizienz voneinander unterschieden. Genotypisch wies der Großteil der Zellen tetraploide Chromosomensätze mit 80 Einzelchromosomen auf. Die exakte Orientierung an den ermittelten optimalen Kulturbedingungen war, durch Reduktion von Störfaktoren einer kultivierungsbedingten zellulären Beeinträchtigung, Grundlage der Aussagekraft und Reproduzierbarkeit weiterführender strahlenbiologischer Analyseverfahren. Anhand mathematisch (Single-Hit-Multi-Target-Modell & Linearquadratisches Modell) ermittelter Kenngrößen aus generierten DEKs ließen sich die LLC1-Zellen als strahlensensible Zellen mit mäßig bis schlecht ausgeprägter Reparaturkapazität einstufen, die strahlenbiologisch eher einem frühreagierenden Zellsystem entsprechen. Trotz einer generell eher schwach ausgeprägten Reparaturkapazität waren die Mechanismen der schnellen DNA-DSB Reparatur intakt und entsprachen sowohl zeitkinetisch als auch dimensional denen anderer bereits in der Literatur beschriebener maligner Zellen. In der Genexpressionsanalyse zeigte sich für LLC1-Zellen keine suffiziente Genregulation p53 abhängiger Gene nach Photonenbestrahlung. Die reparaturrelevanten Gene RRM2b und ERCC1, das apoptoserelevante BAX und das zellzyklusregulierende CDKN1A waren durch Photonenbestrahlung nicht induzierbar. Gene mit p53 unabhängigen Regulationsmechanismen wie das zellzyklusregulierende Gen GADD45 und die apoptoserelevanten Gene BCL2 und BIRC5 waren induzierbar und führten in LLC1-Zellen zu G2-Arretierung und Apoptoseinduktion nach Photonenbestrahlung. Dabei erfolgte die Verschiebung des zellulären Gleichgewichts hin zu proapototischen Mechanismen nach Photonenbestrahlung nicht durch Überexpression des, in LLC1-Zellen nicht strahleninduzierbaren, proapoptotischen Gens BAX, sondern primär durch Unterexpression antiapoptotischer Gene wie BCL2/BIRC5 mit konsequenterweise fehlender Hemmung der Apoptoseinduktion. Nach Exposition gegenüber hohen Dosen (6 Gy) leiten LLC1-Zellen einen GADD45 vermittelten, lang andauernden, potentiell zeitlich unbegrenzten G2-Arrest ein. Hingegen war nach Bestrahlung mit geringeren Dosen von 2 Gy ein Ende des G2-Arrests zwischen 18 h und 24 h post rad festzustellen. Eine G1-Arretierung erfolgt in LLC1-Zellen auch nach Exposition gegenüber 6 Gy Photonen nicht. Im quantitativen screening mittels Westernblot zeigte sich in LLC-Zellen eine p21 Defizienz als Ursache der fehlenden G1-Arretierung, eine Phosphorylierung von p53 an Serin 15 war hingegen nachweisbar und zeigte einen strahleninduzierten Anstieg auf Proteinebene. Die daraufhin durchgeführte p53 Mutationsanalyse mittels Gensequenzierung zeigte in Sequenz 1 (94-115 forward) an Basenposition 120 eine heterozygote Mutation zum STOP-Codon UAA. Durch diese Mutation ist eine suffiziente Proteinbiosynthese des p53-Proteins in LLC1-Zellen nicht möglich und eine Funktionalität des Proteins nicht gegeben. Diese fehlerhafte Proteinstruktur des p53 erklärt sowohl den fehlenden G1- Arrest, die p21-Defizienz als auch die fehlende Induzierbarkeit p53- abhängiger Gene wie CDKN1A, RRM2b, ERCC1 und BAX auf mRNA-Ebene, bei gleichzeitig gelelektrophoretisch nachweisbarem p53