Untersuchungen zur Rolle der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und des NADP+-Malat-Enzyms in der filamentösen Phaeophycee Ectocarpus siliculosus

In der filamentösen Braunalge Ectocarpus siliculosus liegen die Enzyme Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) und das NADP+-Malat-Enzym in hohen Aktivitäten vor. Die Beteiligung beider Enzyme an einem für die Alge vorgeschlagenen C4/CAM-Metabolismus wurde fraglich, nachdem zum einen nicht alle der für einen vollständigen Zyklus benötigten Enzyme nachgewiesen werden konnten und zum anderen mögliche Metabolite in vivo in zu geringen Konzentrationen vorlagen, um für den postulierten Speichermetaboliten von CO2 in Frage zu kommen. Daraus ergab sich die Frage nach der zellulären Funktion der Enzyme. Zur Klärung der Funktion sowohl der PEPCK als auch des NADP+-Malat-Enzyms wurden die Enzyme aus E. siliculosus isoliert und gereinigt. Dabei wurde für die native PEPCK eine relative molekulare Masse von 90 kDa ermittelt. Nach Denaturierung in der SDS-PAGE zeigte sich ein 62 kDa- sowie ein prominenteres 18 kDa-Polypeptid. Die relative molekulare Masse des nativen NADP+-Malat-Enzyms wurde mit 440 kDa bestimmt. In der SDS-PAGE zeigte sich ein einzelnes 56 kDa-Polypeptid, und es wurde geschlossen, dass das funktionelle Enzym als Oktamer vorliegt. Für alle der für die Carboxylierungsreaktion der PEPCK benötigten Substrate ergaben sich normale Michaelis-Menten-Kinetiken mit den Km-Werten 1,46 mM (CO2), 0,5 mM (PEP) und 0,23 mM (ADP). Auch für die Decarboxylierungsreaktion des Malat-Enzyms zeigte sich mit Malat eine normale Michaelis-Menten-Kinetik (Km = 0,36 mM). Im Fall des NADP+ wurde das Vorliegen positiver Kooperativität mit einem Hill-Koeffizienten von 2,74 nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, daß das Enzym über mindestens drei Bindungsstellen für NADP+ verfügt. Zur Herstellung spezifischer Antikörper gegen beide Enzyme wurden Kaninchen mit den denaturierten Polypeptiden nach der SDS-PAGE immunisiert. Trotz wiederholtem Ansatz und verlängertem Standardimmunisierungsprogramm ergab sich ein geeignetes Antiserum nur für das 18 kDa-Polypeptid der PEPCK. Die IgG-Fraktion dieses Serums reagierte sowohl mit dem 18 kDa- als auch mit dem 62 kDa-Polypeptid der PEPCK, was darauf hindeutet, dass beide Polypeptide Degradationsprodukte eines wahrscheinlich monomeren nativen Polypeptids sind. In Immunlokalisationsstudien mit diesem Antikörper wurde die PEPCK in den Pyrenoiden von E. siliculosus nachgewiesen. Ebenso befindet sich die Rubisco, nachgewiesen mit einem Antikörper gegen das native Enzym aus Spinat, in den Pyrenoiden. Die Lokalisation der PEPCK in direkter Nachbarschaft zur Rubisco schließt erneut die Funktion eines C4-Mechanismus bei E. siliculosus aus. Eine anaplerotische Rolle der PEPCK in den Zellen der Alge ist wahrscheinlich