Das endogene Retrovirus HTDV/HERV-K: Untersuchungen zur Funktion des akzessorischen Proteins Rec

Retroviren benutzen für die Transkription und Translation ihrer Gene den zellulären Transkriptions– und Translationsapparat. In eukaryotischen Zellen wird die RNA nach der Transkription prozessiert, erst danach verlässt sie den Kern. Die RNA Prozessierung beinhaltet u.a. das vollständige Entfernen von Intronsequenzen (Spleißen). Bei Retroviren erfolgt die Translation bestimmter Proteine (Gag, Pol, Env) von ungespleißten und unvollständig gespleißten Transkripten. Um den nukleären Export dieser Transkripte sicherzustellen, haben Retroviren unterschiedliche Mechanismen entwickelt. Bei dem humanen endogenen Retrovirus HERV K wird der Transport der ungespleißten und unvollständig gespleißten RNA über ein RNA Adaptor Protein reguliert. Solche posttranskriptionellen Regulatorproteine findet man auch bei anderen komplexen Retroviren, wie HIV und HTLV. Die regulatorischen Proteine HIV/Rev und HTLV/Rex sind sehr gut untersucht. Rev und Rex binden über sequenzspezifische Motive an charakteristische Bereiche auf der viralen RNA, die responsiven Elemente. Für die Ausbildung eines funktionalen Exportkomplexes müssen Rev und Rex auf der RNA oligomerisieren. In einem zweiten Schritt bilden Rev und Rex einen Komplex mit dem zellulären Exportrezeptor Crm1, der den Export des RNA/Protein-Komplexes vermittelt. Das HERV K spezifische RNA Adaptor Protein Rec zeigt große Ähnlichkeit zu Rev und Rex. Auch Rec bindet an einen charakteristischen Bereich auf der viralen RNA, das Rec responsive Element (RcRE). In unabhängigen in vivo und in vitro Funktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Rec an das RcRE nicht, wie bei Rev und Rex, über ein sequenzspezifisches Motiv erfolgt. Mehrere „Stem Loop“ Strukturen sind am Aufbau eines funktionalen Exportkomplexes beteiligt. Die Deletion von jeweils einer von vier relevanten „Stem-Loop“ Strukturen führt in vitro nicht zum Verlust der Rec Bindung, in vivo wird aber der Aufbau eines aktiven Exportkomplexes verhindert. Für einen funktionalen Rec/RcRE Komplex sind offensichtlich mehrere Kontaktpunkte wichtig. Rev und Rex binden über eine argininreiche Domäne an ihre responsiven Elemente. Rec besitzt ebenfalls eine argininreiche Domäne, die für die RNA Bindung von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Dissertation konnte mit Hilfe von in vitro RNA Protein Bindungsstudien gezeigt werden, dass neben der argininreichen Domäne noch weitere Aminosäuren im Bereich von zwei leucinreichen Domänen für die RcRE Bindung von Bedeutung sind. Die Mutation des Tryptophan an Position 50 sowie der Leucin Reste an Position 53, 77 oder 78 führte jeweils zum Verlust der RNA Bindung. Aufgrund der physikalischen Eigenschaften dieser Aminosäuren kommt nur das Tryptophan als potentieller Kontaktpunkt zur RNA in Frage. Die übrigen Leucin Reste sind wahrscheinlich für die richtige Faltung des Proteins von Bedeutung. Zusammenfassend haben die Untersuchungen zum RcRE und zur RNA Bindedomäne von Rec ergeben, dass für einen funktionalen Rec/RcRE Komplex sowohl Rec als auch RcRE RNA eine bestimmte Struktur besitzen müssen. Bei Rev und Rex ist Oligomerisierung essentiell für den Aufbau eines funktionalen Exportkomplexes. Die Befunde aus den in vivo Funktionstests und in vitro RNA Protein Bindungsstudien, die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführt wurden, legen nahe, dass Multimerisierung auch bei Rec für die Funktion essentiell ist. Im Unterschied zu Rev und Rex, scheint Rec nur als Dimer oder maximal als Tetramer an das RcRE zu binden und nicht als Oligomer. Der Export der viralen Transkripte erfolgt bei Rev und Rex im Komplex mit Crm1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir mit Hilfe von Crm1 Kompetitionsexperimenten, die mit „Pendel“ Proteinen, die das NES von Rev und Rex trugen, durchgeführt wurden, indirekt zeigen, dass Crm1 am Rec abhängigen RNA Export beteiligt ist. Über Ko Immunpräzipitation ist es uns gelungen eine direkte Interaktion zwischen Crm1 und Rec nachzuweisen. Crm1 bindet häufig über leucinreiche Exportsignale (NES) an sein Exportcargo. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir erstmals zeigen, dass sich das NES von Rec im Bereich der zweiten leucinreichen Domäne (AS 77-83) befindet und nicht, wie in der Literatur beschrieben, im Bereich der ersten leucinreichen Domäne (AS 50-59) lokalisiert ist. Die Untersuchungen deuten auch darauf hin, dass das NES von Rec nur im Rahmen der nativen Rec Struktur funktional ist. Zusammenfassend haben die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen gezeigt, dass die drei regulatorischen Proteine Rev, Rex und Rex zwar die gleiche Funktion besitzen, dass sich aber die Funktionsweise von Rec deutlich von der von Rev und Rex unterscheidet. Während bei Rev und Rex die Funktion über Sequenzmotive gesteuert wird, spielt bei Rec die Proteinfaltung eine entscheidende Rolle