Untersuchung lysosomaler Membranproteine mit dem Schwerpunkt der Charakterisierung der Acetyl-Coenzym A: a-Glucosaminid N-Acetyltransferase aus lysosomalen Membranpräparationen aus humaner Plazenta

Die Acetyl-CoA-Glucosaminid-N-Acetyltransferase ist ein lysosomales Protein, dessen Ausfall das Sanfilippo C-Syndrom (Mukopolysaccharidose Typ IIIC, OMIM 252930) bedingt. Dabei handelt es sich um eine von elf durch distinkte Enzymdefekte bedingten Mukopolysaccharidosen. Durch den Ausfall der lysosomalen Acetyltransferase kommt es zu einer Störung des Heparansulfatabbaus mit einer Ansammlung von Stoffwechselprodukten im Lysosom. Die zugrunde liegende Gensequenz wurde 2006 von Fan et al. und Hrebicek et al. beschrieben. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war eine Anreicherung und Solubilisierung der lysosomalen Acetyltransferase. Das Enzym wurde aus humaner Plazenta gewonnen. Nach einer Anreicherung lysosomaler Membranproteine durch Immunaffinitätsabsorption wurden die Membranen mit Detergentien solubilisiert und die extrahierten Membranproteine durch verschiedene Verfahren fraktioniert. Hierzu wurden die Extraktionsbedingungen optimiert sowie Gelfilration und Ionenaustauscherchromatographie verwendet. In den so gewonnenen Fraktionen wurde die Aktivität von Acetyltransferase bestimmt und die Fraktionen höchster Aktivität durch SDS-PAGE und 2D-Elektrofokussierung/SDS-PAGE weiter charakterisiert. Eine Isolierung markierter Acetyltransferase konnte wegen eines im Rahmen der zweidimensionalen Trennung aufgetretenen Verlusts des markierten Proteins nicht erreicht werden. Es zeigte sich jedoch, dass die Markierung wenig spezifisch war. Nach eindimensionaler Trennung wurde in dem als wahrscheinlich für die Acetyltransferase geltenden Molekulargewichtsbereichen die alkalische Phosphatase identifiziert. Auf Grund der vorliegenden Ergebnisse erscheint die Hypothese von Bame und Rome (1986) über Bildung eines acetylierten Enzymintermediats als wenig wahrscheinlich. Durch uns konnte erstmals die Assoziation der Acetyltransferase zu rafts gezeigt werden. Versuche mit -Cyclodextrin zeigten, dass die optimale Aktivität der Acetyltransferase von der Anwesenheit von Cholesterin, einem typischen Bestandteil von DRMs (detergent resistant membranes) abhängig ist. Die hier beschriebenen Trennmethoden und Solubilisierung und die erstbeschriebene Bedeutung von Cholesterin für die Aktivität der Acetyltransferase können eine Grundlage künftiger Isolierung und Rekonstitution des Membranproteins in Liposomen werden