Methoden zur Evaluation des neuronalen Zelltods in hippokampalen und kortikalen Primärkulturen der Ratte

Die große medizinische und ökonomische Bedeutung des Schlaganfalls hat in den vergangenen Jahren zu intensiver Forschung geführt. Die verzögerte Neurodegeneration, wie sie in der Penumbra abläuft, stellt einen viel versprechenden Ansatz zur neuroprotektiven Therapie dar. Hier laufen nach dem ischämischen Ereignis neurodegenerative Prozesse ab, auf die pharmakologisch Einfluss genommen werden kann und die zu einer Prognoseverbesserung dieses Krankheitsbildes führen können (Lo, 2003). Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Vergleichbarkeit von einander abweichender Labormethoden zur Bestimmung der Zellschädigung. Von besonderem Interesse war eine Vereinfachung der quantitativen Auswertung des Zelltods in neuronalen Zellkulturen anhand der photometrischen Messung. Ein weiterer Schwerpunkt war die Untersuchung der Zellschädigung und die Neuroprotektion unterschiedlicher Substanzen unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs. Eine mit dem Farbstoff Trypanblau gefärbte Nervenzellkultur wurde bei Wellenlängen von 570 und 590 nm photometrisch vermessen, was keinen signifikanten Unterschied ergab. Auch die Zellschädigung von acht und dreizehn Tage alten Zellkulturen zeigte vergleichbare Ergebnisse. Daraus lässt sich herleiten, dass Ergebnisse, die auf methodischen Unterschieden, wie das Alter der Kultur oder verschiedene Wellenlängenbereiche bei einer photometrischen Auswertung basieren, sehr gut vergleichbar sind. Beim Vergleich der photometrischen Messung mit der Auszählung einer Zellkultur zeigten sich ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Methoden. Jedoch war die Streuung der durch photometrische Messung ermittelten Ergebnisse deutlich größer als bei der Auszählung. Bei Methoden, die eine höhere Ungenauigkeit erwarten lassen, wie die photometrische Messung, sollte das bei der Planung der Versuche, zum Beispiel durch eine höhere Zahl der Einzelversuche, mit in Betracht gezogen werden. Hinsichtlich der Schädigung durch Glutamat war in der vorliegenden Arbeit weniger die Konzentration, als die Dauer der Einwirkung für das Ausmaß der Schädigung der Neurone ausschlaggebend. Dieser Faktor sollte beim Vergleich von Ergebnissen annähernd gleich sein. Die Substanz Dizocilpin führte bei Glutamatschädigung zu einer signifikanten Reduktion des Zellschadens. Auch bei der Schädigung durch NMDA war die Substanz neuroprotektiv wirksam. Das zeigt, dass Dizocilpin im Rahmen einer exzitotoxischen Zellschädigung über die Blockade der NMDA-Rezeptoren signifikant neuroprotektiv wirksam ist. Um die Wirksamkeit von neuroprotektiven Substanzen unter den Bedingungen einer ischämischen Zellschädigung in der Nervenzellkultur beurteilen zu können, wurde das Modell des Sauerstoff-Glukose-Entzugs näher untersucht. Neuroprotektive Substanzen, die sich im Tiermodell als wirksam erwiesen hatten (Culmsee et al., 2001, 2004), erreichten auch unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs eine Reduktion des Zellschadens. So kam es unter dem Einfluss von Pifithrin unter diesen Bedingungen zu einer signifikanten Reduktion an geschädigten Zellen. Memantine und Clenbuterol zeigten in der vorliegenden Arbeit keinen stark schützenden Effekt. Zum einen könnte das durch die zu kurze Vorbehandlungszeit von nur einer Stunde, zum anderen durch die hohe Grundschädigung und die verhältnismäßig schwache Schädigung durch Sauerstoff-Glukose-Entzug bedingt sein. Als Ursache für den hohen Grundschaden kommen unterschiedliche Präparationsbedingungen und die Verwendung unterschiedlicher Zellkulturen in Frage. Die schwache Schädigung könnte durch eine Hypothermie der Zellkulturen während der langen Behandlung oder durch einen unzureichenden Sauerstoffentzug verursacht sein. Es handelt sich beim Sauerstoff-Glukose-Entzug um ein etabliertes Modell, das unter kontrollierten Bedingungen Aufschluss über die ischämische Zellschädigung geben kann. Es ist jedoch sinnvoll auf gleiche Präparationsbedingungen und Zellkulturen zu achten und die Temperatur und den Sauerstoffgehalt in den Kulturen unter den Bedingungen des Sauerstoff-Glukose-Entzugs zu ermitteln, um solche Nebeneffekte sicher auszuschließen