Purificación y caracterización de la actividad enzimática de una endoglucanasa proveniente deTrametes versicolor

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular.La biomasa lignocelulósica es una materia prima renovable prometedora para la producción de combustibles y productos químicos que está disponible a gran escala. Además, la disminución de las reservas de petróleo, junto con el aumento de las emisiones de gases de efecto invernadero, ha dado lugar a la producción y utilización de biocombustibles. En los últimos años, diversos estudios se han centrado en la investigación de diferentes tecnologías para la producción de bioetanol de segunda generación y productos químicos, siendo los bioprocesos basados en hidrólisis enzimática los que se muestran como la opción prometedora. Una etapa crítica del proceso es la conversión de los residuos lignocelulósicos a azúcares fermentables. La bioconversión de la celulosa es catalizada por un grupo de enzimas denominadas celulasas. En trabajos previos se identificó y clonó el gen codificante para una endoglucanasa desde Trametes versicolor (TvEG). El cDNA codificante para la proteína madura fue completamente secuenciado y clonado en el vector pPIC9K, y se expresó como una enzima extracelular activa en la levadura Pichia pastoris KM71. En el presente estudio, como principal objetivo, se purificó y caracterizó TvEG, y se evaluó su potencial hidrolítico en sustratos celulósicos. La cromatografía de intercambio iónico utilizando un FPLC permitió la purificación y concentración de esta enzima desde el sobrenadante del cultivo. Tras análisis mediante SDS-PAGE, se encontró un tamaño molecular mayor a los 42,3 kDa esperados. La hidrólisis catalizada por TvEG en carboximetilcelulosa (CMC) fue máxima a pH 5,6 y 55ºC. La enzima fue estable en un rango de pH de 3 a 9, y hasta los 55ºC; temperatura sobre la cual la estabilidad disminuyó rápidamente después de la incubación durante 15 min. TvEG tuvo la capacidad de liberar azúcares reductores desde papel filtro, Avicel, xilano y paja xiii de trigo. No obstante, las tasas de liberación en comparación a lo obtenido desde CMC fueron bajas, a excepción de lo obtenido desde Avicel (0,0461%) considerando la alta cristalinidad del sustrato. En conclusión, TvEG es una endoglucanasa mesófila. Esta enzima ha demostrado una alta capacidad para liberar azúcares reductores a partir de celulosa cristalina, por lo que podría tener potenciales aplicaciones en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica.Lignocellulosic biomass is a promising renewable feedstock for production of fuels and chemicals that is available at large scale. In addition, the declined oil reserves together with the increased greenhouse gas emissions, has led to the production and use of biofuels. In the last years, several studies have focused on the research of different technologies for the production of second generation bioethanol and chemicals, being enzymatic hydrolysis bioprocesses shown as the promising option. A critical stage in the process is the conversion of lignocellulosic residues into fermentable sugars. The bioconversion of cellulose is catalyzed by a group of enzymes called cellulases. At previous works the gene coding for an endoglucanase (TvEG) from Trametes versicolor was identified and cloned. The cDNA encoding for the mature protein was completely sequenced and cloned into the pPIC9K vector, and expressed as an active extracellular enzyme in the yeast Pichia pastoris KM71 (Salinas et al, 2011). In the present study, as main objective, TvEG was purified and characterized, and its hydrolytic potential in cellulosic substrates was evaluated. Ion exchange chromatography using FPLC allowed the enzyme purification and concentration from the culture supernatant. After SDS-PAGE analysis, a molecular size higher than the 42,3 kDa expected was found. The hydrolysis catalyzed by TvEG in carboxymethyl cellulose (CMC) was maximal at pH 5,6 and 55°C. The enzyme was stable in a pH range of 3 to 9, and up to 55ºC; above which stability decreased rapidly after incubation for 15 minutes. TvEG had the ability to release reducing sugars from filter paper, Avicel and wheat straw. However, the release rates compared to that obtained from CMC were lower, except for Avicel (0,0461%) considering the substrate high crystallinity. xv In conclusion, TvEG is a mesophilic endoglucanase. This enzyme had been shown a high capacity to release reducing sugars from crystalline cellulose, so could have potential applications in the hydrolysis of lignocellulosic biomas