The characterization of hyaluronic acid by gel permeation chromatography coupled to multi-angle light scattering

Cieľom tejto dezertačnej práce bolo pripraviť vzorky hyaluronanu s rozličnou mólovou hmotnosťou, experimentálne zistiť navhodnejšie podmienky pre GPC-MALS analýzu kyseliny hyalurónovej a porovnať túto metódu s ostatnými často používanými metódami stanovenia mólovej hmotnosti. Ďalším čiastkovým cieľom bolo objasnenie molekulárnej štruktúry tohto zaujímavého biopolyméru. V úvode sa práca zaoberá teóriou stanovenia mólovej hmotnosti, vysvetlením separačného mechanizmu a inštrumentácie. Ďalej sú predstavené alternatívne metódy stanovenia mólovej hmotnosti a molekulárnej distribúcie hyaluronanu. Experimentálna časť zahŕňa zoznam použitých chemikálií a spotrebného materiálu, spôsoby prípravy vzoriek a medodológiu používanú pre meranie. Posledná časť práce je rozdelená do niekoľkých kapitol, ktoré sa zaoberajú prípravou hyaluronanu s rozličnou mólovou hmotnosťou, optimalizáciou separačných podmienok GPC-MALS analýzy a porovnaním metódy s ostatnými často používanými technikami stanovenia mólovej hmotnosti, a to s frakcionáciou tokom v poli a analytickou ultracentrifugáciou. Posledná časť je venovaná štúdiu roztokových vlastností hyaluronanu v širokom rozsahu mólových hmotností pomocou viskozimetrie s použitím klasického kapilárneho Ubbelohdeho viskozimetru a kombinácie gélovej permeačnej chromatografie s viac uhlovým detektorom rozptylu svetla a on-line viskozimetrom.The aim of this thesis was prepare the hyaluronan samples with various molar masses, determine the most suitable conditions for GPC-MALS analysis of hyaluronic acid, and compare the method with other commonly used techniques. The last partial aim was to study the molecular structure of this interesting and important biopolymer in solution. At the beginning work deals with theoretical basics of method, explanation of separation mechanism, instrumentation and with introducing other techniques that can be used for evaluation of molar mass and molar mass distribution of hyaluronan. Experimental part covers up the list of used materials, preparation of samples and methodology of accomplished measurements. Final part of this work is divided into several chapters. The first chapter deals with the preparation of sodium hyaluronate with various molar masses, the second one demonstrates optimization of the GPC separation conditions and in the third part the GPC-MALS is compared to other commonly used techniques, such as field-flow fractionation and analytical ultracentrifugation. The final section demonstrates the study of solution properties of sodium hyaluronate covering broad molar mass range carried auto by classical viscosimetry using an Ubbelohde capillary viscometer and by a combination of gel permeation chromatography coupled to multi-angle light scattering detector and an no-line capillary viscometer.Ústav chemie a technologie makromolekulárních látekPředseda komise prof. Šňupárek představil disertantku Mgr. Martinu Hermannovou. Konstatoval, že přítomno je šest z osmi členů komise a všichni tři jmenovaní oponenti. Předseda komise přečetl životopis uchazečky, stanovisko školícího pracoviště a doporučení školitelky. Poté uchazečka seznámila komisi s obsahem své disertační práce. Oponenti přečetli své posudky, uchazečka zaujala stanovisko k připomínkám oponentů, své odpovědi předala v písemné formě a jsou přílohou tohoto zápisu. Poté předseda vyzval k diskusi i ostatní členy komise. Mgr. Martina Hermannová reagovala na dotazy přítomných, které uspokojivě zodpověděla. Diskuse se zúčastnili všichni členové komise. Diskuse se týkala problematiky podmínek analýzy, mechanismu dělení na GPC kolonách, otázky větvení a tzv. síťování makromolekul, standardizace analytických metod pro farmacii a kosmetický průmysl, oblasti použití hyaluronové kyseliny v souvislosti se stupněm čistoty a obsahem proteinů. V neveřejném zasedání komise zhodnotila vystoupení Mgr. Martiny Hermannové a tajným hlasováním všemi hlasy (6/0) rozhodla pro udělení akademického titulu doktor - Ph.D. Výsledek hlasování byl oznámen uchazečce.Dokončená práce s úspěšnou obhajobo