Analytical parameters of determination of lipid content in cerumen using preparative thin layer chromatography

Předložená diplomová práce se zabývá problematikou ušního mazu ve vztahu k určení analytických vlastností. Součástí práce bylo ověřit metodiku stanovení pěti tříd lipidů, která byla již v minulosti k analýze vzorku ušního mazu používána. Modifikace stávajícího pracovního postupu, které nejlépe vypovídaly byly následně použity k vlastní analýze 23 vzorku ušního mazu se zaměřením na závislosti pěti lipidových frakcí cerumina (fosfolipidy, diacylglyceroly, volné mastné kyseliny, triacylglyceroly a estery cholesterolu). Separace byla prováděna metodou preparativní chromatografie na tenké vrstvě. Získaná experimentální data byla statisticky vyhodnocena, k analýze dat byla použita analýza rozptylu, metoda hlavních komponent, faktorová analýza a analýza shluku. Analýza rozptylu testovala významnost faktoru pacient a opakovatelnost. Faktor pacient je statisticky významný zatímco opakovatelnost je statisticky nevýznamná. Metoda stanovení ušního mazu pomocí preparativní tenkovrstevné chromatografie je tedy reprodukovatelná a nedochází ke změnám složení v různých částech naakumulovaného vzorku ušního mazu. Rozdíly pozorované mezi jedinci jsou statisticky významné. Pomocí exploratorní analýzy dat byla prokázána dostatečná proměnlivost v datech pěti vyšetřovaných znaků ušního mazu, která potvrdila možnost užití dalších metod vícerozměrné statistické analýzy. Jelikož řada znaků při vyšetřování metodou exploratorní analýzy naznačovala dostatečnou korelaci, mohla se následně provést metoda hlavních komponent i faktorová analýza. Metodou hlavních komponent za použití zdrojové matice středních hodnot u pěti vyšetřovaných znaků fosfolipidy - PL, diacylglyceroly - DG, volné mastné kyseliny - VMK, triaclyglyceroly - TG a estery cholesterolu - ECH s využitím Hornovy pivotové polosumy malého výběru byl zjišten optimální počet hlavních komponent dvě a bylo odhaleno, že volné mastné kyseliny a diacylglyceroly silně pozitivně korelují, diacylglyceroly s volnými mastnými kyselinami nekoreluje s fosfolipidy ani s estery cholesterolu, a že fosfolipidy negativně korelují s estery cholesterolu. Užitím metody shluku bylo zjištěno, že triacylglyceroly, volné mastné kyseliny a diacylglyceroly jsou si vzájemně podobné, avšak silně nepodobné s estery cholesterolu a s fosfolipidy. Práce odhalila nové informace týkající se problematiky ušního mazu a přispěla tak k rozšíření znalostí o ušním mazu.The thesis considers the topic of the earwax analysis, specifically, the accuracy of the standard used methodology and its analytical properties. Firstly the established Thin Layer Chromatography methodology of the five lipid fractions separation was verified. Than the currently used techniques were optimized and subsequently utilized for the analysis of the earwax on the sample of 23 subjects with regards to the five earwax lipid fractions (phospholipids, diglycerides, free fatty acids, triglycerides and cholesterol esters) separation. The obtained experimental data were statistically evaluated adopting the Analysis of Variance, Principal Components Analysis, Factor Analysis and Clusters Analysis. Using the Analysis of Variance the significance of the "patient" and "repeatability (of measurements)" factors was assessed. The factor "patient" was appraised as statistically significant whereas the factor "repeatability (of measurements)" as statistically insignificant. Based on the results it was concluded that the earwax analysis, using the Thin Layer Chromatography methodology, is repeatable and the composition of the diverse parts of the accumulated earwax sample can be regarded as similar. The differences between the tested subjects were assessed as statistical significant. Adopting the Exploratory Data Analysis the sufficient variability of the five investigated earwax attributes and thus the possibility of using further multidimensional statistic analysis was verified. Since the correlation between most of the attributes was found, the consecutive use of Principal Components Analysis and Factor Analysis was confirmed. Utilizing the Principal Components Analysis (using the average values source matrix of the five phospholipids investigated attributes - diglycerides, free fatty acids, triglycerides and cholesterol esters - and exploiting Horn's Estimation of Average Values method) the optimal number of main component (i.e. two) was found. Further the strong positive correlation between diglycerides and free fatty acids, any correlation between diglycerides/ free fatty acids and neither phospholipid nor cholesterol esters, negative correlation between phospholipids and cholesterol esters were revealed. Adopting the Clusters Analysis the similarity of diglycerides, free fatty acids and triglycerides but also their unlikeness to cholesterol esters and phospholipids was disclosed. In the thesis new information regarding the currently used earwax analysis methodology were disclosed, that can further improve the earwax examination techniques.Katedra biologických a biochemických vědDokončená práce s úspěšnou obhajobo