Determination of branched-chain amino acids using HPLC with fluorescence detection

Stanovení aminokyselin s rozvětveným řetězcem (valinu, leucinu a isoleucinu), methioninu, fenylalaninu a tyrosinu je v současné době nejspolehlivějším přístupem pro diagnostiku nemoci javorového sirupu, hypermethioninemie, fenylketonurie a tyrosinemie. Byla vyvinuta HPLC metoda pro stanovení aminokyselin s rozvětveným řetězcem, methioninu, fenylalaninu a tyrosinu v plazmě a plné krvi. Před separací jsme provedli derivatizaci těchto aminokyselin pomocí o ftaldialdehydu. Pro separaci jsme použili chromatografickou kolonu LiChroCart 125 4 Purospher RP 18e, 5 ?m. Efluent byl monitorován pomocí fluorescenčního detektoru. Jako mobilní fázi A jsme použili 25 mmol/l Na2HPO4 - methanol (90:10, v/v), pH 6,5?0,1, jako B 100% methanol. Analytické parametry metody byly vyhovující pro všechny stanovované aminokyseliny. Kalibrační křivka byla lineární v celém rozsahu testovaných koncentrací. Orientační hodnoty u skupiny dobrovolných dárců krve byly 231,69 36,12 ?mol/l pro valin, 191,55 35,03 ?mol/l pro leucin, 55,34 10,79 ?mol/l pro isoleucin, 37,26 35,71 ?mol/l pro methionin, 73,17 10,01 ?mol/l pro fenylalanin a 51,08 11,87 ?mol/l pro tyrosin. Orientační hodnoty u novorozenců byly 166,34 40,01 ?mol/l pro valin, 139,84 31,36 ?mol/l pro leucin, 51,08 13,02 ?mol/l pro isoleucin, 22,06 4,70 ?mol/l pro methionin, 71,79 15,39 ?mol/l pro fenylalanin a 127,75 31,78 ?mol/l pro tyrosin. Vyvinuli jsme jednoduchou, relativně rychlou a selektivní HPLC metodu s fluorimetrickou detekcí pro stanovení aminokyselin s rozvětveným řetězcem, methioninu, fenylalaninu a tyrosinu v plazmě a suché krevní skvrně. Prezentovaná metoda je citlivá, přesná a správná pro vyšetřované vzorky a je vhodná jak pro výzkumné účely, tak také pro klinickou praxi.The determination of branched-chain amino acids (valine, leucine and isoleucine), methionine, phenylalanine and tyrosine is presently the most reliable direct approach to the diagnosis of maple syrup urine disease, hypermethioninemia, phenylketonuria and tyrosinemia. A HPLC method for measurement of branched-chain amino acids, methionine, phenylalanine and tyrosine in plasma and whole blood has been developed and evaluated. Before the separation, the amino acids were derivatized with o phthaldialdehyde. For the separation, reverse phase column LiChroCart 125 4 Purospher RP 18e, 5 ?m, was used. Efluent was monitored with fluorescence detector. The mixture 25 mmol/l Na2HPO4 - methanol (90:10, v/v), pH 6.5?0.1 was used as mobile phase A and 100% methanol was used as mobile phase B. The analytical performance of this method is satisfactory for determination of all amino acids. The calibration curve was linear in the whole range tested. The preliminary reference ranges in a group of blood donors are: 231.69 36.12 ?mol/l of valine, 191.55 35.03 ?mol/l of leucine, 55.34 10.79 ?mol/l of isoleucine, 37.26 35.71 ?mol/l of methionine, 73.17 10.01 ?mol/l of phenylalanine and 51.08 11.87 ?mol/l of tyrosine for plasma. The preliminary reference ranges in newborns are: 166.34 40.01 ?mol/l of valine, 139.84 31.36 ?mol/l of leucine, 51.08 13.02 ?mol/l of isoleucine, 22.06 4.70 ?mol/l of methionine, 71.79 15.39 ?mol/l of phenylalanine and 127.75 31.78 ?mol/l of tyrosine. We have developed a simple, relatively rapid and selective HPLC method with fluorescence detection for the determination of branched chain amino acids, methionine, phenylalanine and tyrosine in plasma and dried blood spots. This method provides excellent sensitivity, precision, and accuracy in follow-up samples and is suitaible for research whereas can be easily for clinical testing purposes.Katedra biologických a biochemických vědDokončená práce s úspěšnou obhajobo