Protéine-kinases et cancer du rein : Découverte et validation d’une nouvelle combinaison d’inhibiteurs ciblant les protéine-kinases ATM et CK2

Renal cell carcinoma accounts for 3% of all malignant diseases in adults making it the 10th most common cancer in France. The most frequent type of Kidney cancer is Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CCRCC). Almost all CCRCC show an inactivation of the Von Hippel Lindau tumour suppressor gene (VHL). Between 25-30% of the patients will develop metastatic renal cell carcinoma (mRCC) by the time they are diagnose or become unresponsive to all treatments and in these cases, the disease has a rapid progression. Over the past years, kinase-targeted therapies (Sunitinib, Sorafenib, Temsirolimus) have become the mainstay of treatment for mRCC, however, most, if not all, patients acquire resistance to these approaches over time.In this context my PhD had 3 goals: a) to find a new combinatory targeted therapy through a High Throughput Screening; b) to establish 3D models mimicking the real environment of the tumours (spheroids, Tissue Slice Culture); c) to validate the Hits through different molecular and cellular biology studies.We conducted a synthetic lethal screen on the CMBA platform (CEA-Grenoble), choosing 36 potential genes targets and 80 kinases inhibitors drugs. Each of the target gene was silenced by a transduction with shRNA Lentivirus into the 786-O cell line derived from ccRCC that lacks the tumour suppressor VHL, is radio- and chemo-therapy resistant, has increased mobility and is highly metastatic. Among the hit combinations that affect cell viability, one of them was chosen because it targets two important kinases involved in cell survival and DNA repair: CK2 and ATM. Moreover, this combination is specifically more active in the 786-O VHL- cells than in 786-O VHL+ cell line. We evaluated the effect of our drugs on the viability of our 786-O VHL+ and VHL- cells in normoxic (21% O2) or hypoxic (1.5% O2) conditions that reflect different environments that are present in a tumour. Surprisingly, in normoxia, we found a synergetic effect of the drug mix only on the 786-O VHL- cells but not on 786-O VHL+ cells. Furthermore, this effect was even stronger in conditions of Hypoxia (up to 20% of synergism).Mechanistically, an up-regulation of the stress pathways was much stronger in the VHL- cells in the presence of the combination than with the drugs alone. No apoptosis was detected in this 2D models. In Multi-Cellular Tumour Spheroid (MCTS) where the organization of a micro-tumour is reproduced, our drugs are even more effective in inducing cell apoptosis than in 2D monolayers of 786-O VHL- cells. These results also demonstrate that pharmaco-modulation of viability of renal tumour organotypic culture by chemical combination targeting protein kinases can be studied. Perspectives of this work are the validation of this drug combination on human renal tumours and the use of organotypic culture as a test for personalized treatment response.L’incidence du cancer du rein et sa mortalité associée se sont accrues au cours des dernières années. Le type de cancer rénal le plus fréquent est celui nommé Cancer Rénal à Cellules Claires (CRCC) où le plus souvent, le gène suppresseur de tumeur Von Hippel Lindau (VHL) est inactivé. Malgré une détection plus précoce, l’évolution de la pathologie demeure incertaine, en particulier quand les patients développent des métastases ou acquièrent une résistance au traitement (25-30% des patients). De nouvelles thérapies ciblant des kinases (Sunitinib, Sorafenib ou Temsirolimus) bien que très prometteuses conduisent très souvent à l’acquisition de résistance. Dans ce contexte, il est urgent de développer de nouveaux modèles prédictifs de la réponse des patients aux traitements et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.Ma thèse de science visait trois objectifs complémentaires : 1) Identifier par criblage chimio-génomique des kinases comme cibles thérapeutiques combinées. 2) Etablir deux modèles de culture 3D de cancer du rein qui intègrent le microenvironnement d’une tumeur: les sphéroïdes et la culture organotypique de coupe de tissus. 3) Etudier la chimio-sensibilité de ces modèles à une combinaison de molécules identifiées dans le criblage.Un criblage cellulaire a été réalisé sur la plateforme de Criblage de Molécules BioActives (CEA- Grenoble). Il a consisté à tester 80 molécules inhibitrices de protéine-kinases en combinaison avec l’extinction génique par interférence ARN (shRNAs lentiviraux) de 36 cibles potentielles connues pour leur implication dans divers cancers. La lignée cellulaire choisie (786-O) est dérivée d’une tumeur rénale à cellules claires radio et chimio-résistante et dépourvue de VHL. Parmi les touches qui compromettent la viabilité des cellules 786-O, la combinaison choisie pour son efficacité cible deux kinases importantes dans le contrôle de la survie cellulaire et de la réparation de l’ADN CK2 et ATM. Le statut VHL des cellules module de façon dramatique leur sensibilité à cette combinaison, l’association de ces deux inhibiteurs étant plus efficace sur les cellules 786-O (VHL -) que sur les mêmes cellules dans lesquelles VHL a été réintroduit (VHL+). Au sein d’une tumeur, les différents niveaux d’oxygénation constituent une variation environnementale supplémentaire créant des susceptibilités ou des résistances aux traitements thérapeutiques. Pour déterminer l’impact de nos molécules dans ce contexte, nous avons testé la viabilité des cellules 786-O VHL+ et VHL- dans des conditions normoxiques (21% O2) ou hypoxiques (1,5% O2), en présence des molécules seules ou en combinaison. En normoxie, une diminution synergique de la viabilité des cellules 786-O VHL- est observée en présence de la combinaison, alors que cet effet n’a pas lieu sur les cellules 786-O VHL+. Cette synergie est potentialisée en condition hypoxique. Au niveau mécanistique, les voies de signalisation de stress cellulaires sont d’avantage activées dans les cellules VHL- en présence de la combinaison de molécules comparé au traitement avec chacune des molécules seules. Dans les sphéroïdes tumoraux multicellulaires reproduisant l’organisation d’une micro-tumeur, nos résultats montrent que notre combinaison de molécules induit d’avantage l’apoptose des cellules VHL- que les molécules seules, alors que les cellules VHL+ ne sont sensibles à aucun des traitements.Ces résultats montrent que l’action de nos molécules combinées est clairement plus efficace dans un modèle 3-D. Ils démontrent également qu’il est possible d’objectiver une pharmaco-modulation de la viabilité de cultures organotypiques de tumeur du rein par des combinaisons d’inhibiteurs chimiques de protéine-kinases. Les perspectives de ce travail sont la validation de cette combinaison sur des tumeurs humaines et l’exploitation des cultures organotypiques comme test personnalisé de réponse aux traitements