Selezione di aptameri oligonucleotidici in grado di legare la proteina mieloperossidasi: possibili strumenti molecolari per diagnostica ed imaging.

Il presente lavoro di Tesi è stato svolto presso l’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa, nell’ambito di un progetto per lo sviluppo di aptameri da sperimentare in ambito diagnostico attraverso tecniche di “imaging” molecolare. Gli aptameri sono oligonucleotidi sintetici a DNA o RNA capaci di legare differenti classi di bersagli con alta affinità e selettività. Si tratta di molecole con proprietà anticorpo-simile ma che presentano caratteristiche vantaggiose rispetto agli anticorpi: limitata immunogenicità, possibilità di sintesi chimica, maggiore resistenza alla denaturazione, capacità di rinaturazione spontanea e maggior possibilità di trasferimento all’interno di cellule e tessuti. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di selezionare aptameri specifici per la proteina mieloperossidasi (MPO). La proteina MPO è un emo-enzima immagazzinato e rilasciato dai granuli azzurrofili dei neutrofili polimorfonucleati e dei macrofagi. Questa proteina è stata considerata per lungo tempo un enzima coinvolto solamente nella difesa dell’ospite. Negli ultimi anni, però, essa ha attirato l’attenzione per il suo coinvolgimento nei processi di danno infiammatorio vascolare, in particolare nell’aterosclerosi. Infatti l’infiltrazione dei macrofagi e dei neutrofili partecipa alla trasformazione delle placche aterosclerotiche da stabili ad instabili e l’abbondanza della proteina MPO, riscontrata in studi recenti nelle placche instabili, ha indotto a ipotizzarne un ruolo attivo nella degenerazione della placca. Da qui l’interesse verso la progettazione di molecole che si leghino specificamente alla proteina MPO allo scopo di rilevare la presenza di placche instabili. Gli aptameri qui realizzati sono stati selezionati a partire da una vasta collezione combinatoria di oligonucleotidi a DNA sintetizzata chimicamente. La collezione utilizzata nel presente lavoro ha una lunghezza di 76 bp. È costituita da una regione centrale casuale di 34 nucleotidi, affiancata da due regioni definite che rappresentano le regioni in cui si appaieranno i primer “reverse” e “forward” necessari per le reazioni di amplificazione mediante tecnica di “Polymerase Chain Reaction – PCR”. La selezione è stata eseguita tramite il metodo “Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment” (SELEX), una metodica che coinvolge cicli ripetuti di due processi: 1. La SELEZIONE, ovvero la separazione delle sequenze che legano la molecola bersaglio da quelle che non la legano, tramite l’applicazione di metodi di affinità; 2. L’AMPLIFICAZIONE delle sequenze selezionate tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR). Dopo un certo numero di cicli di selezione, le sequenze che legano MPO sono state clonate in cellule batteriche tramite l’utilizzo di un plasmide. Dalle colture dei batteri sono state recuperate diverse colonie ciascuna delle quali potenzialmente conteneva il plasmide contenente una delle sequenze selezionate Accertata l’avvenuta integrazione del frammento all’interno del plasmide recuperato da ciascuna delle singole colonie, gli oligonucleotidi plasmidici sono stati sottoposti ad analisi di legame al fine di enucleare quelli dotati di maggiore affinità verso la proteina. Queste analisi sono fondamentali per capire la specificità degli aptameri e la loro capacità di riconoscimento della proteina, anche in funzione della sua concentrazione. Una volta compiute le suddette analisi, gli aptameri considerati migliori sono stati sequenziati per definirne sia l’esatta sequenza nucleotidica indispensabile per effettuare una successiva sintesi chimica, sia la relativa struttura secondaria e terziaria. Compiuto quest’ultimo passaggio, gli aptameri ottenuti potranno essere coniugati a fluorofori o vari altri marcatori utili nelle diverse tecniche analitiche che verranno impiegate per evidenziare la presenza della proteina MPO. La realizzazione di aptameri che legano la proteina MPO costituisce quindi un importante risultato ottenuto nel corso di questa tesi sperimentale e rappresenta un primo passo per la realizzazione di uno strumento diagnostico di “imaging” molecolare per evidenziare la presenza di placche aterosclerotiche instabili e guidare così le scelte terapeutiche. ABSTRACT This thesis work was carried out at the Institute of Clinical Physiology of the CNR in Pisa, within a project for the development of aptamers to be tested in the diagnostic field through molecular imaging techniques. Aptamers are synthetic oligonucleotides both DNA or RNA-based capable of binding different classes of targets with high affinity and selectivity. These are molecules with antibody-like properties but which have advantageous features compared to the antibodies: limited immunogenicity, possibility of chemical synthesis, greater resistance to denaturation, capacity of spontaneous renaturation and greater ability to transfer within cells and tissues. The aim of this work was the selection of specific aptamers for the myeloperoxidase protein (MPO). The MPO protein is a heme-enzyme stored and released from azurophilic granules of polymorphonuclear neutrophils and macrophages. This protein has been considered for a long time an enzyme only involved in host defence. In recent years, however, it has attracted attention for his involvement in the processes of inflammatory vascular damage, particularly in atherosclerosis. The infiltration of macrophages and neutrophils participate in the transformation of atherosclerotic plaques from stable to unstable and the abundance of the MPO protein, found in recent studies in unstable plaques, has led to hypothesize an active role in the degeneration of the plaque. Hence the interest in the design of molecules that specifically bind the MPO protein in order to detect the presence of unstable plaques. Aptamers produced here were selected from a large combinatorial collection of DNA oligonucleotides chemically synthesized. The collection used in this study has a length of 76 bp. It consists of a random central region of 34 nucleotides flanked by two defined regions that represent the regions where the reverse and forward primers indispensable for the amplification reactions using technique of Polymerase Chain Reaction – PCR pair. The selection was performed by the method Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX), a method that involves repeated cycles of two processes: 1. The SELECTION: separation of sequences that bind the target from those that do not bind, via the application of affinity methods; 2. The AMPLIFICATION of the selected sequences by the polymerase chain reaction (PCR). After a dozen of cycles of selection, the sequences that bind MPO were cloned into bacterial cells through the use of a plasmid. From the bacteria cultures were recovered several colonies, each containing the plasmid with one of the selected sequences. Established the successful integration of the fragment within the plasmid recovered from each of the individual colonies, the oligonucleotides amplified from the plasmids were subjected to binding assays in order to determine those with higher affinity towards the protein. These analyses are critical for understanding the aptamers specificity and their capacity of recognition of the protein, also as a function of its concentration. Once performed the above analysis, the aptamers considered best were sequenced to obtain the exact nucleotide sequence essential to carry out a subsequent chemical synthesis, and to know its secondary and tertiary structure. Accomplished this last step, the obtained aptamers may be conjugated to fluorophores or various other markers useful in the different analytical techniques that will be used to highlight the presence of the MPO protein. The realization of aptamers that bind the MPO protein constitutes an important result obtained in the course of this experimental thesis and represents a first step towards the realization of a diagnostic instrument of molecular imaging to highlight the presence of unstable atherosclerotic plaques and drive the treatment choices