Studio del ruolo dei microRNA nella resistenza acquisita al vemurafenib in melanoma.

Il melanoma metastatico è una forma avanzata di melanoma che mostra una bassissima sensibilità ai farmaci chemioterapici. Quando il melanoma aggiunge la fase metastatica (stadio IV), l’aspettativa di vita del paziente è di soli 6-8 mesi. Il 50% di tutti i melanomi possiede una mutazione della proteina BRAF nella posizione V600. BRAF è una chinasi coinvolta nel pathway delle MAP chinasi (MAPK), una delle maggiori vie di segnalazione che induce le cellule a proliferare. Negli ultimi anni un’attiva ricerca e’ stata diretta a sviluppare farmaci antitumorali in grado di inibire selettivamente BRAF mutato. Il primo farmaco di questa famiglia (vemurafenib (PLX 4032)) e’ stato approvato per l’uso clinico nel 2011. Il vemurafenib ha un tasso di risposta del 50% e il tumore regredisce dopo poche settimane. Tuttavia, dopo circa 6 mesi di trattamento con il farmaco, tutti i pazienti mostrano la ricomparsa delle metastasi, un fenomeno definito come resistenza acquisita. Riuscire a comprendere i meccanismi che causano la resistenza acquisita delle cellule di melanoma metastatico nei confronti del vemurafenib ha un’importanza cruciale per una terapia efficace contro questo tumore particolarmente aggressivo. Lo scopo di questo lavoro di tesi è l’identificazione dei microRNA coinvolti nel fenomeno della resistenza acquisita al vemurafenib. Durante la prima parte del mio lavoro, ho ottenuto 3 cloni resistenti al farmaco (2.1, 2.2, 2.3), coltivando la linea parentale A375 con mezzo addizionato con vemurafenib per un periodo di 4-8 settimane. Ho quindi verificato l’effettiva resistenza al farmaco di tali cloni attraverso vari saggi cellulari e molecolari. Tutti e tre i cloni sono risultati insensibili al farmaco e caratterizzati da una riattivazione del pathway delle MAPK. Tramite sequenziamento ho verificato che il profilo mutato BRAF V600E della linea parentale è mantenuto nei cloni. Successivamente ho stabilito se la resistenza acquisita al vemurafenib dei 3 cloni e’ attribuibile ad uno dei meccanismi già noti in letteratura. In questa fase ho trovato: due nuove forme di splicing alternativo di BRAF V600E che sono svincolate dalla regolazione da parte di RAS; elevati livelli della kinasi COT che agisce a valle di RAF;. elevati livelli di ABCB1, trasportatore di membrana che permette di espellere farmaci all’esterno della cellula. Lo studio dei miRNA differenzialmente espressi fra la linea parentale A375 e il clone resistente 2.2 è stato poi effettutato analizzando i dati del sequenziamento dell’intero miRNoma fatto con Deep Sequencing. Sono stati cosi’ selezionati 3 miRNA over-espressi e 9 down-regolati nel clone 2.2 rispetto alla linea parentale A375. Il mio lavoro di tesi proseguira’ con studi di validazione di tali miRNA, sia in vitro che in vivo, allo scopo di verificare se essi sono causalmente connessi al fenomeno della resistenza acquisita al vemurafenib