Indol-3-ilgliossilammidi quali ligandi al Traslocatore Proteico, 18 kDa: valutazione biologica

Il Traslocatore Proteico (TSPO, 18 kDa) è una proteina mitocondriale transmembrana ubiquitaria, coinvolta in un ampio spettro di attività all'interno della cellula, quali omeostasi cellulare, apoptosi, immunomodulazione e steroidogenesi. Tale proteina è presente in quantità elevate nei tessuti endocrini e nel fegato, a causa dell’importante ruolo che riveste nella biosintesi degli steroidi e degli acidi biliari. Essendo una proteina di membrana, la determinazione della sua struttura è un compito estremamente difficoltoso, ma da un punto di vista funzionale, l'unità minima del TSPO nei mammiferi sembra essere il monomero, che lega ad alta affinità molecole quali PK11195 e colesterolo. Numerosi lavori, suggeriscono che il TSPO si associ anche con altre proteine, sia citosoliche che mitocondriali, per espletare le sue funzioni. E' stato evidenziato che si verifica anche la transiente associazione di monomeri di TSPO a formare polimeri non covalenti. L’associazione del TSPO con proteine quali VDAC e ANT (poro di transizione della permeabilità mitocondriale, MPT-poro) è responsabile del suo coinvolgimento nell’apoptosi, mentre l’associazione dei monomeri può svolgere un ruolo importante nella sintesi degli steroidi. Molti studi hanno dimostrato come ligandi selettivi per il TSPO possano agire come potenziali agenti terapeutici per il trattamento sia di tumori, attraverso la modulazione dell'MPT-poro, che di patologie a carattere ansioso, attraverso la modulazione della sintesi di neurosteroidi. Recentemente è stata osservata anche la capacità per alcuni di ligandi al TSPO di favorire la rigenerazione nervosa periferica. Scopo del presente lavoro di tesi è stata la valutazione biologica di nuovi ligandi al TSPO, sviluppati sulla base del modello farmacoforico attualmente conosciuto. Sono stati saggiati dal punto di vista biologico 36 nuovi composti appartenenti alla classe N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidica. Come prima cosa è stata valutata l'affinità dei nuovi composti di sintesi per il TSPO tramite studi di binding radioattivo, effettuati su membrane di rene di ratto, usando come agente competitore un ligando classico al TSPO, PK11195. Il radiobinding ha permesso di valutare la concentrazione di ligando di nuova sintesi capace di inibire per il 50% il binding del [3 H]PK11195 al TSPO. Dal valore di IC50 è stata calcolata la costante d’inibizione Ki tramite l’equazione di Cheng e Prusoff. Successivamente i ligandi che hanno mostrato maggiore affinità al TSPO sono stati valutati per la capacità di stimolare la produzione di pregnenolone in cellule C6 di glioma di ratto, utilizzando un modello validato per lo studio della steroidogenesi. Le cellule sono state incubate con specifico mezzo salino (privo di siero e addizionato con inibitori del metabolismo del pregnenolone) e trattate con i ligandi affini al TSPO. Dopo opportuna incubazione, la quantità di pregnenolone rilasciata dalle cellule nel mezzo è stata quantificata mediante test immunoenzimatico. In ultimo, è stato condotto uno studio preliminare di proliferazione cellulare, atto ad individuare l’eventuale attività proliferativa del composto che ha mostrato la maggiore capacità di indurre sintesi di pregnenolone. L’insieme dei risultati ottenuti, in termini di affinità, stimolo della steroidogenesi e capacità proliferativa, rende questi ligandi dei buoni candidati per lo sviluppo di nuovi composti quali utili strumenti nelle neurodegenerazioni