Analisi proteomica di fattori rilasciati da cellule muscolari lisce vascolari: caratterizzazione di microvescicole e secretoma totale

Il secretoma è l’insieme delle proteine rilasciate da una cellula, un tessuto o un organo in determinate condizioni. Le proteine secrete, presenti nei fluidi biologici e nei mezzi condizionati di colture cellulari, possono risultare in forma solubile o essere integrate in vescicole membranose. Queste ultime sono strutture sferiche, delimitate da un bilayer lipidico, che contengono molecole bioattive quali RNA, microRNA e proteine trasferibili a cellule bersaglio. La composizione delle vescicole dipende dal tipo cellulare da cui derivano e possono intervenire nella comunicazione intercellulare sia attraverso il rilascio del contenuto nell’ambiente circostante sia tramite l’interazione con molecole di superficie o endocitosi della vescicola da parte delle cellule bersaglio. Queste strutture in base ad aspetti morfologici e al meccanismo di formazione sono classificate in esosomi e microvescicole. Lo studio delle vescicole è interessante perchè, attraverso il trasferimento di molecole bioattive, svolgono un ruolo importante sia in condizioni fisiologiche che patologiche, e potrebbero rappresentare potenziali biomarcatori per la diagnosi, per la sorveglianza di determinate condizioni di salute e avere anche applicazioni terapeutiche. In questo lavoro di tesi abbiamo utilizzato un protocollo per la purificazione e caratterizzazione delle vescicole a partire dal terreno condizionato di colture cellulari con lo scopo di effettuare specifici studi di proteomica. La tecnica che abbiamo usato per isolare dal terreno di coltura le microvescicole è l’ultracentrifugazione differenziale. Per la caratterizzazione abbiamo utilizzato tecniche di immunoblotting, con anticorpi diretti contro marcatori specifici vescicolari, e l’analisi al microscopio elettronico per avere informazioni sulla morfologia. Il protocollo messo a punto è stato utilizzato per isolare vescicole da colture cellulari primarie di VSMCs (vascular smooth muscle cells) ottenute da un’arteria coronaria di maiale. Questo modello in vitro è interessante in quanto l'attivazione di queste cellule in vivo ha un ruolo molto importante nell'insorgenza e sviluppo delle malattie cardiovascolari. Il secretoma totale e le microvescicole rilasciate da VSMCs in condizioni quiescenti e attivate sono stati analizzati mediante spettrometria di massa. Sono state identificate specifiche proteine che potrebbero avere un ruolo importante nel passaggio dalla condizione fisiologica a quella patologica