Valutazione di biomarkers su molluschi bivalvi quali indicatori di inquinamento ambientale

ABSTRACT For many years, the problem of environmental pollution and its harmful effects on food products has been addressed through the evaluation of type, quantity and, in some cases, theoretical toxicity of each chemical compound. The pollution sources are not uniformly distributed and the toxic substances are released in the environment in a discontinuous manner and often they are subject to transformations which are difficult to predict. Moreover, in the case of substances released in the sea, it is important to consider that water masses are continuously moving and the environmental conditions change rapidly. In polluted ecosystems, the pollutants may alter the health status of organisms, causing the “stress syndrome” which is a physiological alteration induced by environmental change. Such alteration can be quantified using specific indicators, called biomarkers. Biomarkers are defined as “biochemical, cellular, physiological or behavioural changes which can be measured in body tissues, in fluids or at the level of the whole organism (individual or population) and reveal the exposure to one or more chemical pollutants” (Depledge, 1994). Biomarkers have been used since the seventies, and their use has been intensified in the last two decades in the environmental biomonitoring programs. The use of biomarkers as indicators of the presence of stress factors and environmental pollutants, can be very effective to evaluate whether a population lives in a risky environment and can hence accumulate harmful substances which damage the species itself or the consumer. Biomarkers can therefore be used in the field of diagnostics and food safety in addition to classical chemical and toxicological analysis. Generally, only 30-40 substances can be quantified, although more than 100.000 substances could be present in the environment (problem of significance of overall assessment). Chemical analyses are costly and very specific and it is not possible to perform them for all environmental pollutants theoretically present (normally, only evaluations required by law are performed). Additionally, none of the available chemical methodologies is able to precisely assess the real available fraction over the total and thus the real amount which can potentially interact with the biota (problem of identification of cause-effect relation). Biomarkers can be effectively used as a method of screening both in fish and molluscs, allowing a targeted use of chemical analysis in case of a positive result which would indicate the presence of an environmental pollutant. The research for this thesis focused on the preparation and utilization of biomarkers on bivalves sampled during monitoring activities in the production areas in Tuscany and Puglia. The biomarkers that have been used are both non-specific general stress indicators (neutral red assay) and specific exposure biomarkers (acetylcholinesterase activity, micronuclei frequency). These biomarkers have been applied on various matrices of bivalves (hepatopancreas, hemolymph and gills) in order to monitor their health status and the quality of the production areas. RIASSUNTO Il problema dell’inquinamento ambientale e dei suoi effetti nocivi sugli alimenti è stato per anni affrontato valutando il tipo, la quantità e, in taluni casi, la tossicità teorica dei singoli composti chimici. Le sorgenti di inquinamento sono diffuse in maniera non uniforme e le sostanze tossiche sono immesse nell’ambiente in maniera discontinua e spesso possono subire trasformazioni difficilmente prevedibili. Per le sostanze immesse in mare va inoltre considerato che le masse d’acqua sono in continuo movimento e di conseguenza le caratteristiche dell’ambiente subiscono modificazioni repentine. In ecosistemi inquinati, le sostanze tossiche alterano lo stato di salute degli organismi provocando una “sindrome da stress”, ovvero un’alterazione misurabile dello stato fisiologico indotta da un cambiamento ambientale. Tale alterazione può essere quantificata mediante l’utilizzo di opportuni indici, i biomarker. I biomarker sono definiti come “ … quella variazione biochimica, cellulare, fisiologica o comportamentale che può essere misurata in un tessuto, in un fluido biologico o a livello dell’intero organismo (individuo o popolazione) e che fornisce l’evidenza di un’esposizione a uno o più composti inquinanti…” (Depledge, 1994). L’utilizzo dei biomarker, a partire dagli anni ‘70, si è intensificato negli ultimi due decenni nei programmi di biomonitoraggio in campo ambientale. Il loro uso, come indicatori di contatto con fattori di stress e contaminanti ambientali, può essere molto efficace per verificare se una popolazione animale vive in un ambiente a rischio e, quindi, possa accumulare sostanze nocive in grado di danneggiare la specie stessa o il consumatore. Possono così essere utilizzati anche nel campo della diagnostica e della sicurezza alimentare integrando le analisi chimiche e tossicologiche classiche. In generale è possibile effettuare determinazioni quantitative solo per circa 30-40 sostanze chimiche, mentre sono più di 100.000 quelle che potrebbero essere presenti nell’ambiente (problema di significatività della valutazione complessiva). Le analisi chimiche sono costose e, per loro natura, molto specifiche; ne consegue necessariamente che non possono essere eseguite verso tutti gli inquinanti teoricamente presenti (di fatto, generalmente, ci si limita alle ricerche previste dalla normativa). A questo va aggiunto che nessuna metodologia chimica è in grado di stabilire con sicurezza qual è, sul totale presente, la frazione realmente biodisponibile e quindi in grado di interagire con il biota (problema di identificazione delle relazioni causa – effetto). I biomarkers possono, invece, essere efficacemente utilizzati come metodo di screening sia nei pesci che nei molluschi consentendo un uso mirato dell’analisi chimica quando una loro positività segnala la presenza di un inquinante ambientale. Sulla base di quanto detto, il lavoro di tesi ha previsto l’allestimento e l’applicazione di biomarkers su campioni di molluschi bivalvi prelevati durante le attività di monitoraggio delle zone di produzione della Regione Puglia e in tre diversi siti della costa Tirrenica. I biomarkers utilizzati sono sia indicatori generici di stress, aspecifici (saggio del rosso neutro) che biomarker di esposizione, specifici (attività dell’acetilcolinesterasi, frequenza dei micronuclei). Questi biomarkers sono stati applicati su diverse matrici di molluschi bivalvi (epatopancreas, emolinfa e branchie) al fine di monitorare il loro stato di salute e la qualità delle zone di produzione