ATTIVITA' ANTI-TROMBOTICA DI UNA NUOVA CLASSE DI COMPOSTI:I DERIVATI DEL PIRIDO(1,2-a)PIRIMIDIN-4-ONE

RIASSUNTO Background: La rottura della placca aterosclerotica, con trombi associati, è causa di infarto miocardico e ictus. In seguito alla rottura si attivano dei sistemi antiemorragici che richiamano piastrine e fattori della coagulazione che vanno a costituire il tappo emostatico o trombo. I mediatori centrali dell’emostasi sono le piastrine: frammenti di cellule prive di nucleo e ricchi di granuli, che mutano profondamente struttura, forma e volume in relazione al grado e allo stadio di attività. Le vie che portano all’attivazione piastrinica sono diverse e vedono il coinvolgimento del collagene, dell’ ADP (adenosina difosfato), del trombossanoA2 (TXA2) e della trombina. In seguito all’attivazione, le piastrine possono aggregare attraverso legami recettoriali. Poiché la patologia atero-trombotica ha uno sviluppo complesso, emerge la necessità di disporre di terapie farmacologiche con azione multipla ed in diversi stadi della malattia. Noi abbiamo disegnato e sintetizzato molecole con attività multi-target, in grado cioè di contrastare questa patologia in vari aspetti del suo sviluppo. I nostri composti nascono come molecole ad attività anti-aterogena. Abbiamo precedentemente sperimentato con successo, sulle cellule endoteliali, le loro proprietà sulla proliferazione, sull’infiammazione e sullo stress ossidativo. Obiettivo: Lo scopo di questa tesi è di valutare l’azione di composti di nuova sintesi sull’attivazione e sull’aggregazione piastrinica “in vitro” indotta da vari agonisti. Metodi: L’attivazione è stata valutata su plasma ricco di piastrine (PRP) di donatori sani, mediante il parametro MPC (Mean Platelet Component) del sistema ematologico ADVIA® 120, che esprime il cambiamento di forma delle piastrine, e mediante un saggio cito-fluorimetrico, utilizzando come indicatore di attivazione piastrinica l’espressione della P-selettina, una proteina di superficie presente solo nelle piastrine attivate. L’aggregazione invece è stata valutata sia su sangue intero (in impedenza aggregometrica, Chrono-Log) che su PRP (mediante un saggio spettrofotometrico). I nuovi composti, denominati DB-F e SS-V, sono stati disegnati apportando delle modifiche chimiche al nucleo strutturale dei flavonoidi e la loro attività è stata confrontata con quella dell’SS-U, una molecola strutturalemente simile al flavonoide apigenina, ma appartenente ad un’altra classe di composti. Il range di concentrazione utilizzato varia tra 12,5 e 100 μM. L’attivazione e l’aggregazione piastrinica sono state indotte da quattro diversi agonisti: U46619 (analogo del TXA2), Collagene, ADP e Trombina. Risultati: L’attivazione piastrinica indotta da U46619 (200 nM) è stata inibita significativamente da tutti i composti testati. L’aggregazione indotta da U46619 (1000 nM), è stata anch’essa inibita significativamente dalle nostre sostanze in maniera concentrazione-dipendente. Utilizzando altri agonisti (ADP, Collagene e Trombina), i composti DB-F ed SS-U hanno un’esigua inibizione dell’aggregazione piastrinica, mentre il composto SS-V inibisce significativamente sia l’aggregazione indotta da Collagene che quella da Trombina a 1 e 2U/mL. L’efficacia inibitoria di DB-F a 100 μM sull’aggregazione indotta da U46619 a 2 μM è indipendente dal tempo di pre-incubazione. A concentrazioni più basse (25 e 50 μM) DB-F inibisce efficacemente se aggiunto da 10 a 40 minuti prima, mentre se aggiunto simultaneamente all’agonista inibisce in maniera inferiore. Infine, dato che i composti da noi testati hanno una struttura simil-flavonoide, l’attività di uno di questi, il DB-F, è stata confrontata con quella della quercetina (molecola capostipite della classe dei flavonoidi). I risultati hanno dimostrato che, rispetto alla quercetina, il DB-F inibisce maggiormente sia l’attivazione che l’aggregazione piastrinica indotta da U46619. Studi competitivi, con un inibitore selettivo del recettore del TXA2 (SQ29548), hanno confermato che l’inibizione di SS-U sulle risposte piastriniche ai vari agonisti, è correlata alla loro abilità a competere per il legame al recettore del TXA2. Conclusioni: I composti DB-F, SS-U e SS-V hanno manifestato un’azione inibente l’attivazione e l’aggregazione piastrinica a concentrazioni compatibili con un loro utilizzo in vivo. Queste proprietà potrebbero essere attribuite alla loro capacità di legarsi al recettore piastrinico del TXA2. L’azione inibitoria del composto SS-V potrebbe essere attribuita anche ad altri sconosciuti meccanismi intra- ed extra-cellulari su cui è necessario indagare