Metodi microbiologici e molecolari per il rilevamento di Dekkera bruxellensis durante il processo di vinificazione

I lieviti appartenenti alla specie Dekkera bruxellensis sono considerati i maggiori responsabili della produzione di fenoli volatili, causando ingenti perdite economiche nell'industria enologica. Lavori recenti hanno evidenziato che questo lievito può entrare nello stato vitale ma non coltivabile (VBNC) in seguito all’aggiunta di anidride solforosa, il principale preservante chimico utilizzato in enologia, e che la capacità di questi lieviti di produrre fenoli volatili viene mantenuta anche quando le cellule si trovano in questo stato. Conseguentemente, le cellule D. bruxellensis VBNC in vini trattati con solforosa, sebbene non coltivabili ma ancora vitali, possono essere considerate come microrganismi alteranti del vino. Scopo della presente tesi è stato quello di individuare e quantificare, nell’ambito di una sperimentazione svolta in un’azienda vitivinicola, la presenza di lieviti appartenenti alla specie D. bruxellensis durante le diverse fasi di processi di vinificazione di uve Sangiovese. A tale scopo sono state utilizzate tecniche microbiologiche classiche unitamente a tecniche molecolari quali la PCR-DGGE e la Real Time PCR. Quest’ultime, applicate sul DNA estratto direttamente dalla matrice uva/pigiato/vino, sono capaci di evidenziare i microrganismi anche quando presenti nello stato vitale e non coltivabile. Mediante l’analisi microbiologica è stato possibile evidenziare la presenza di D. bruxellensis in alcune fasi del processo di vinificazione quali fine fermentazione alcolica, fine fermentazione malolattica e invecchiamento pre-acidificazione. Sono stati isolati in coltura pura 311 ceppi, identificati mediante tecniche molecolari appartenenti a D. bruxellensis. Tali ceppi sono stati inseriti nella collezione di germoplasma di questo lievito presente presso la sezione di microbiologia del DBPA per futuri studi di diversità genomica e funzionale. L’amplificazione PCR della regione D1/D2 del gene 26S rDNA con i primers NL1-GC e LS2 e la successiva separazione degli amplificati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide all’8% con gradiente di denaturanti 20-75%, sono state messe a punto utilizzando preliminarmente campioni di vino che presentavano odori fenolici. L’analisi dei campioni di uva/pigiato/vino prelevati durante le diverse fasi della trasformazione non ha permesso di evidenziare frammenti ascrivibili a D. bruxellensis in alcuna fase del processo. A differenza di quanto ottenuto mediante PCR-DGGE la tecnica Real Time PCR, che ha previsto l’impiego di primers (BretF/BretR) disegnati sul gene rad4 di D. bruxellensis per produrre un frammento di 108 pb specifico per tale specie, ha permesso di rilevare e quantificare questo lievito nelle varie fasi del processo di vinificazione anche quando presente in concentrazioni molto basse. Nell’ambito della presente tesi è stata inoltre analizzata la produzione di fenoli volatili durante le diverse fasi del processo di trasformazione uva/vino. Una correlazione tra la quantità di sostanze alteranti prodotte e numero di UFC/ml dei lieviti D. bruxellensis rilevate è stata evidenziata