Caracterización de la respuesta a sequía e identificación de genes asociados al uso eficiente del agua (UEA) en portainjertos Prunus spp.

Un repte bàsic dels programes de millora de patrons és la combinació de toleràncies als estressos abiòtics en els nous híbrids interespecífics per tal d’obtenir patrons adaptats a un ampli rang de condicions edafoclimàtiques. La sequera és un dels principals estressos abiòtics amb un gran impacte ecològic i socioeconòmic a Espanya, en conreus com els Prunus. Hi ha una necessitat urgent d'identificar patrons tolerants a la sequera que puguin respondre a la manca d'aigua. En aquest treball es va estudiar la resposta adaptativa de tolerància a la sequera en diferents portaempelts de Prunus a través de tres enfocaments: (i) comprendre els mecanismes fisiològics implicats en l'estrès hídric controlant l'ús eficient de l'aigua (UEA) en diferents genotips; (ii) determinar la inducció bioquímica relacionada amb l'àcid abscísic (ABA) per a establir relacions entre les respostes fisiològiques i bioquímiques; i (iii) elucidar la resposta genètica a nivells transcriptòmics (a curt i llarg termini) i proteòmic (a curt termini) per a identificar gens candidats relacionats amb la sequera. S'ha aconseguit d’identificar sis espècies silvestres de Prunus amb la millor UEA d'un total de 48 genotips d’aquest gènere mitjançant l'estudi fenotípic del contingut foliar en cendres i la discriminació de l'isòtop 13C (Δ13C), relacionats negativament amb la UEA. Es va determinar la resposta de 'Garnem' i d'altres genotips híbrids evidenciant els diferents mecanismes d'evitació de la sequera presents que permeten de mantenir el contingut hídric, tot i la disminució del potencial hídric foliar (LWP). A més, es va confirmar la resposta bioquímica produïda a les 24h mitjançant l'acumulació foliar d'àcid abscísic (ABA), ratificant el paper clau d'aquesta fitohormona en la resposta a la sequera, i específicament, en la regulació estomàtica a 'Garnem'. D'altra banda, s'han pogut comprovar les diferències de comportament existents entre la resposta a l’estrès hídric en condicions controlades i al camp. Encara que es produeix una resposta fisiològica similar, els arbres no van experimentar un nivell d’estrès sever suficient per a desencadenar una resposta bioquímica basada en la producció d'ABA. L'estudi molecular es va realitzar mitjançant quatre enfocaments diferents. En primer lloc, l'anàlisi de les regions promotores de dos gens relacionats amb la sequera, PpDhn2 i DREB2B revelà l'important paper dels elements cis identificats no només a la sequera, sinó també la seva possible implicació en l'estrès a les baixes temperatures. A més es va realitzar l'estudi filogenètic amb els dos gens en una col·lecció de Prunus. En segon lloc, amb l'anàlisi transcriptòmica a l’arrel de 'Garnem' sotmès a estrès hídric, s'han identificat gens involucrats en les cascades de senyalització i control transcripcional, gens osmoprotectors i gens implicats en el transport d'aigua i ions. En tercer lloc, l'anàlisi proteòmica va revelar canvis significatius en els nivells d'abundància d'una sèrie de proteïnes a l’arrel de 'Garnem' a les 24h d'estrès. Quinze d’aquestes proteïnes van ser identificades en diferents processos biològics, descrits també en l'anàlisi transcriptòmica. Finalment, mitjançant una anàlisi amb microsatèl·lits (SSRs) en quatre progènies híbrides, es va identificar una regió genòmica específica d'ametller diferent de préssec i prunera. Aquesta regió podrà ser útil a nivell de genòmica comparativa per a identificar gens d'interès codificats per l'ametller. Aquest estudi molecular ha permès de triar vuit gens candidats per a la selecció de patrons de Prunus tolerants a la sequera. Aquests van ser el gen de la proteïna LEA, els gens PpDhn1, PpDhn2 i DREB2B, a més dels DEGs: ERF023; LRR receptor-like serine / threonine-kinase ERECTA i NF-Yb3, per la seva relació amb el millor UEA; i finalment el DEG Myb44, repressor de la fosfatasa PPC2, validat mitjançant qRT-PCR. En general, aquests resultats poden contribuir a millorar el coneixement existent sobre els canvis fisiològics, bioquímics i moleculars en resposta a la sequera. La comprensió de les estratègies d'evitació i tolerància serà d'ajuda per a la proposta de nous reptes en la millora de la tolerància a la sequera a patrons de Prunus.El reto en los programas de mejora de portainjertos es la combinación de tolerancias de estreses abióticos en nuevos híbridos interespecíficos para obtener portainjertos adaptados a un amplio rango de condiciones edafoclimáticas. La sequía es uno de los principales estreses abióticos con un gran impacto ecológico y socioeconómico en España para los Frutales de Hueso. Existe una necesidad urgente de identificar portainjertos tolerantes a la sequía que puedan responder a la escasez de agua. En este trabajo se estudió la respuesta adaptativa de tolerancia a la sequía en posibles portainjertos Prunus mediante tres enfoques: (i) Comprender los mecanismos fisiológicos implicados en el estrés hídrico considerando el uso eficiente del agua (UEA) en distintos genotipos; (ii) determinar la inducción bioquímica provocada por el ácido abscísico (ABA) para entender las relaciones entre las respuestas fisiológicas y bioquímicas; y (iii) elucidar la respuesta genética a niveles transcriptómicos (a corto y largo plazo) y proteómico (a corto plazo) para identificar genes candidatos involucrados en la respuesta a la sequía. Se han identificado seis especies silvestres de Prunus con mejor UEA de un total de 48 genotipos de Prunus fenotipando el contenido foliar en cenizas y la discriminación del isótopo 13C (Δ13C), los cuales están relacionados negativamente con el UEA. Se determinó la respuesta de ‘Garnem’ y de otros genotipos híbridos evidenciándose los diferentes mecanismos de evitación a la sequía presentes en ellos que permiten mantener el contenido hídrico, a pesar de la disminución del potencial hídrico foliar (LWP). Además, se la respuesta bioquímica producida a las 24h mediante la acumulación foliar de ABA, confirmó el papel clave de dicha fitohormona en la respuesta a la sequía, a través de la regulación estomática en ‘Garnem’. Por otro lado, se han podido comprobar las diferencias de comportamiento existentes entre la respuesta a estrés hídrico en condiciones controladas y en campo. Donde, a pesar de producirse una respuesta fisiológica similar, los árboles no experimentaron el nivel de estrés necesario para desencadenar una respuesta bioquímica de producción de ABA. El estudio molecular se realizó mediante cuatro enfoques diferentes. En primer lugar, el análisis de las regiones promotoras de dos genes relacionados con la sequía, PpDhn2 y DREB2B, reveló el importante papel de los elementos cis identificados no sólo en el estrés hídrico, sino también su posible implicación en el estrés por bajas temperaturas. Además se realizó el estudio filogenético de estos genes en una colección de Prunus. En segundo lugar, el análisis transcriptómico en raíz de 'Garnem' sometido a estrés hídrico, ha permitido identificar genes involucrados en las cascadas de señalización y control transcripcional, genes osmoprotectores y los genes implicados en el transporte de agua e iones. En tercer lugar, el análisis proteómico reveló cambios significativos en los niveles de abundancia de una serie de proteínas en raíz de 'Garnem' a las 24h de estrés. De las cuales, 15 fueron identificadas en diferentes procesos biológicos, descritos también en el análisis transcriptómico. Finalmente, mediante un análisis con microsatélites (SSRs) en cuatro progenies hibridas, se identificó una región genómica específica de almendro diferente de melocotón y ciruelo. Está región podrá ser útil a nivel de genómica comparativa para identificar genes de interés codificados por el almendro. Este estudio molecular ha permitido elegir ocho genes candidatos para la selección de portainjertos Prunus tolerantes a la sequía. Estos fueron el gen de la proteína LEA, los genes PpDhn1, PpDhn2 y DREB2B, además de los DEGs: ERF023; LRR receptor-like serine/threonine-kinase ERECTA y NF-YB3, por su relación con una mejor UEA; y finalmente el DEG Myb44, represor de la fosfatasa PPC2, validado mediante qRT-PCR. En general, estos resultados pueden contribuir a mejorar el conocimiento existente sobre los cambios fisiológicos, bioquímicos y moleculares en respuesta a la sequía. La comprensión de las estrategias de evitación y tolerancia ayudarán a proponer nuevos retos en la mejora de la tolerancia a la sequía en portainjertos Prunus.The challenge in the rootstock breeding programs is the combination of abiotic stress tolerances in the new interspecific hybrids in order to obtain rootstocks adapted to a wide range of edaphoclimatic conditions. Drought is one of the main abiotic stresses with far-reaching ecological and socioeconomic impact in Spain, for stone fruit crops. Thus, there is an urgent need to identify drought resilient rootstocks that can respond to the water scarcity. In this work the adaptive response leading to tolerance to drought was studied in possible rootstock in Prunus through three approaches: (i) to understand the physiological mechanisms involved in water stress controlling water use efficiency (WUE) in different genotypes; (ii) to determine the biochemical induction related to abscisic acid (ABA) to understand the link between physiological and biochemical responses; and (iii) to elucidate the genetic response at transcriptomic (long- and short-term) and proteomic levels (short-term) to identify useful candidate drought-related genes. Six wild-relative Prunus species were identified with the best WUE from a total of 48 genotypes phenotyping the foliar ash content and Carbon isotope discrimination (Δ13C), which are negatively related to WUE. The response to drought was determined in ‘Garnem’ and other genotypes, which evidenced the different drought avoidance mechanisms allowing them to maintain the water content in spite of a in the leaf water potential (LWP) decrease. In addition, the biochemical response by foliar ABA accumulation at 24h, confirmed the key role of this phytohormone in the drought response, through the stomatal regulation in ‘Garnem’. Moreover, a different behavior between controlled and field-grown conditions was also confirmed. Although a similar physiological response is produced, the studied trees did not experience enough stress level that triggers into a biochemical response based on the ABA production. The molecular study was carried out through four different approaches. Firstly, the analysis of the promoter region of two drought-related genes, PpDhn2 and DREB2B revealed the important role of the cis-elements identified not only in drought, but also their possible involvement in low temperature stress. In addition, a phylogenic study with the two genes was made in a Prunus collection. Secondly, the time-course transcriptome analysis in ‘Garnem’ roots allowed us to identify genes involved in signaling cascades and transcriptional control, genes in acting as osmoprotectants, and genes implicated in water and ion transport. Thirdly, the proteomic analysis revealed significant changes in the abundance levels of a number of proteins in ‘Garnem’ roots at 24h of stress. Out of these, 15 proteins were identified in different biological processes, described also in the transcriptomic study. Finally, a specific almond genomic region different from peach and plum background was identified by a microsatellite (SSR) approach in four hybrid progenies. This region could be useful at comparative genomic level in order to identify interesting traits from almond. From the molecular study, eight candidate genes were chosen for drought tolerant Prunus rootstocks screening. Namely the gene codifying a LEA protein, the genes PpDhn1, PpDHn2 and DRE2B, as well as the DEGs ERF023 TF, LRR receptor-like serine/threonine-kinase ERECTA, and NF-YB3 TF, responsible of WUE improvement were selected; and finally the Myb44 transcription factor (FT), a repressor of PP2C phosphatase, validated by qRT-PCR. Overall, these results may contribute to improve the existing knowledge on the physiological, biochemical and molecular changes in response to drought. The understanding of the avoidance and tolerance strategies will be helpful to suggest new drought-tolerance breeding approaches in Prunus